DNA浓度与纯度的紫外分光光度计法分析

项目三：DNA浓度与纯度的紫外分光光度计法分析一、 实验目的学习利用紫外分光光度计测定DNA浓度和纯度，掌握浓度和纯度的计算方法和实验操作技术。二、 实验原理组成核酸的碱基(G,A,T,C)在260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm的吸收峰即可对DNA进行定量。但有时也会因为所处溶液的pH值不同而导致吸光系数的不同，因此，一般在中性pH值左右的环境中进行测定。这种方法常用于测定比较纯的样品。核酸样品中最常有的其它吸光物质为蛋白质，由于蛋白质在280nm处具有强吸收峰，因此测定A260/A280比率，可以判断DNA的纯度。纯化的DNA及RNA的A260/A280比值应分别接近1.8及2.0，当溶液中含有蛋白质时，会造成A260/A280比值降低。计算原溶液的浓度(A)：A260X转换因子x稀释因子=原溶液DNA浓度(gg/ml)每吸光单位转换因子：双股DNA为50gg/ml；单股DNA或RNA为40gg/ml计算原溶液的摩尔数(以500bp大小的DNA片段为例)：每个脱氧核苷酸的平均分子量近似为324.5，因此分子量=500x324.5=162250摩尔浓度(mol/L)=A/162250x1000三、实验仪器1、紫外-可见分光光度计2、移液器16套（每2人1套）四、 实验材料1、 无菌枪头20此各2支；2、 离心管五、 实验试剂1、 无菌水2、 待测DNA溶液五、实验步骤1、 取标准入DNA，稀释，待用。2、 制作标准曲线（教师完成！）3、 取实验一提取的基因组DNA，稀释50倍后待用。4、 测定A260和A2805、 计算DNA浓度、纯度紫外吸收检测DNA浓度与纯度2007年11月13日星期二11:40目的：了解紫外吸收检测DNA浓度与纯度的原理，掌握测定方法。原理：核酸的最大吸收波长为260nm，蛋白质为280nm，在波长260nm时，1OD值相当于双链DNA浓度为50gg/ml，单链寡核苷酸的含量为30gg/ml，可以据此来计算核酸样品的浓度，还可通过测定在260nm和280nm的OD值的比值（OD260/OD280）,估计核酸的纯度。纯净DNA的比值为1.8,RNA为2.0。若比值高于1.8说明DNA样品中的RNA尚未除尽，若样品中含有酚和蛋白质将导致比值降低。270nm存在高吸收表明有酚的干扰。紫外分光光度法只能用于测定浓度大于0.25gg/ml的核酸溶液，对浓度更小的样品，可采用荧光分光光度法。试剂与仪器：提取的质粒DNA，紫外分光光度仪。操作步骤：1）分光光度计先用水在260nm和280nm两个波长下校零。2）取质粒DNA样品2叫，用水稀释100倍，转入分光光度计的石英比色杯中。3）在260nm和280nm分别读出样品光密度值。754紫外-可见分光光度计操作规程用途：能在紫外、可见光谱区域对样品物质作定性和定量的分析。波长范围：200nm-800nm。操作要点：3、 插上电源，打开开关，打开试样室盖，按“A/T/C/F”键，选择“T%”状态，选择测量所需波长，预热30分钟。4、 开始测量时要先调节仪器的零点，方法为：保持在“T%”状态，当关上试样室盖时，屏幕应显示“100.0”，如否，按“OA/100%”键；打开试样室盖，屏幕应显示“000.0”，如否，按“0%”键，重复2-3次，仪器本身的零点即调好，可以开始测量。3、用参比液润洗一个比色皿，装样到比色皿的3/4处（必须确保光路通过被测样品中心），用吸水纸吸干比色皿外部所沾的液体，将比色皿的光面对准光路放入比色皿架，用同样的方法将所测样品装到其余的比色皿中并放入比色皿架中。7、 将装有参比液的比色皿拉入光路，关上试样室盖，按“A/T/C/F”键，调到“Abs”，按“OA/100%”键，屏幕显示“0.000”，将其余测试样品一一拉入光路，记下测量数值即可（不可用力拉动拉杆）。8、 测量完毕后，将比色皿清洗干净（最好用乙醇清洗），擦干，放回盒子，关上开关，拔下电源，罩上仪器罩，并打扫卫生，才可离开。9、 本操作要点只针对测量吸光度而言。注意事项：7、 仪器使用前需开机预热30分钟8、 开关试样室盖时动作要轻缓9、 不要在仪器上方倾倒测试样品，以免样品污染仪器表面，损坏仪器10、一定要将比色皿外部所沾样品擦干净，才能放进比色皿架进行测定11、有任何疑问请报告指导老师12、使用完毕请认真填写《仪器设备使用登记簿》，并交指导老师签字。浓度测定：在一定范围内，DMA或RNA的光密度0D细与其含量成正比，当使用1颔比色杯，0D倾=1时,dsDNA浓度约为50居/mbssDNA浓度约为37八/皿1,RNA浓度约为4gg/ml；寡核昔酸浓度约为3O.g/m1（由底物不同有差异）o根据以下公式可以汁算DNB在溶液中的浓度：质粒DN乳浓度（*gI冲【）=稀释倍数X00^