高粱中直链淀粉和支链淀粉检测方法研究报告

检测中心文件————方法研究报告拟稿：冯金娜核稿：汪咏曾高粱中直链淀粉和支链淀粉检测方法研究报告【简述】淀粉是一种天然高分子化合物，按照结构可分为直链淀粉和支链淀粉两种。自然淀粉中支链淀粉比例较高，一般约占总淀粉的70%以上，糯高粱中支链淀粉含量尤其高，直链淀粉含量很低，且不同品种、生长时期的高粱其支链淀粉和直链淀粉含量也有差异。直链淀粉是D-葡萄糖基以a-(1,4)糖苷键连接的多糖链，具有抗润胀性，水溶性较差，不溶于脂肪；支链淀粉又称胶淀粉,分子相对较大,难溶于水。高粱是我公司主要的酿酒原料，高粱中直链淀粉和支链淀粉的含量对白酒的出酒率和白酒品质都有重要的影响，因此建立高粱中直链淀粉和支链淀粉的检测方法，对酿酒生产与白酒品质的提升均具有重要的指导意义。根据公司年度计划的要求，检测中心以国家标准GB7648-87《水稻、玉米、谷子粒直链淀粉测定法》为基础建立高粱中直链淀粉和支链淀粉的检测方法。1实验原理淀粉与碘形成碘-淀粉复合物，并具有特殊的颜色反应，支链淀粉与碘生成棕红色复合物，直链淀粉与碘生成深蓝色复合物。在淀粉总量不变的条件下，直链淀粉和支链淀粉的物质波峰处对应的两个波长λ1和λ2，样品在这两个波长下均有吸收。由于吸光度值具有叠加性，测定样品在某一波长下的吸光度值时其结果为直链淀粉和支链淀粉在该波长下吸光度值的总和。由直链淀粉和支链淀粉的性质可知这两种物质与碘反应时互不干扰，故可根据直链淀粉和支链淀粉显色反应后在不同波长下的吸光度值进而将样品中单一组分的吸光度值计算出来，再从建立的回归曲线方程得到相应的含量。2仪器与试剂：2.1试剂实验中所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的三级水。2.1.1氢氧化钠溶液：1moL/L。2.1.2盐酸（1+1）。2.1.32.1.4碘贮备溶液：称取2g碘和20g2.1.5碘试剂：取10mL碘贮备液稀释至100mL2.1.62.1.7高梁支链淀粉2.1.8马铃薯直链淀粉标准溶液：1mg/mL，称取干燥马铃薯直链淀粉标准品（2.1.6）0.1031g（相当于纯品0.1000g）于烧杯中，加入1mL95%乙醇充分湿润，再加9mL1moL/L氢氧化钠溶液，于沸水中分散10min，冷却后转移至100mL容量瓶中并2.1.9高梁支链淀粉标准溶液：1mg/mL，称取干燥高梁支链淀粉标准品（2.1.7）0.1271g（相当于纯品0.1000g）于烧杯中，同2.1.82.2仪器2.2.1粉碎机2.2.2电子天平：FA20042.2.3双光束紫外可见分光光度计：TU-19012.2.4筛子：80目2.2.5索氏提取器3检测波长的选择配制一系列浓度的直链淀粉和直链淀粉标准溶液，加入碘试剂反应10min，在紫外分光光度计中进行全波段扫描，其中支链淀粉最大吸收峰在532nm处，直链淀粉最大吸收峰在641nm处，因此将支链淀粉和直链淀粉的检测波长分别定为532nm和641nm。4空白溶液的确定和直链淀粉、支链淀粉叠加性探究4.1空白溶液的选择准确吸取2.5mL高粱淀粉溶液到100mL容量瓶中，调节pH值为3.0，加入2.0mL碘试剂反应10min后进行测定。其中一组采用蒸馏水作为参比液，另外一组采用试剂空白溶液作为参比液，进行紫外全波段扫描，得到以蒸馏水为参比的扫描图谱和以试剂空白溶液的扫描图谱如图1所示。再对试剂空白溶液进行紫外全波段扫描，其扫描图谱如图2所示。从图1得知用蒸馏水作为参比液测得的紫外数据与试剂空白参比测得的数据在约550nm以上一致，但在550nm以下开始出现差异，其原因是碘开始有紫外吸收，使得水参比实验组呈现出了碘的吸收特点。为保证结果的准确性，故需采用试剂空白溶液作为参比液，来消除碘对碘-淀粉复合物的紫外干扰。图1同一淀粉溶液在不同参比下的紫外吸收光谱图2试剂空白溶液的紫外吸收光谱4.2直链淀粉、支链淀粉叠加性实验取3个100mL容量瓶，准确吸取0.5mL直链淀粉标准溶液（2.1.8）于第一个容量瓶中，取3.5mL支链淀粉标准溶液（2.1.9）于第二个容量瓶中，准确吸取0.5mL直链淀粉标准溶液（2.1.8）和3.5mL支链淀粉标准溶液（2.1.9）于第三个容量瓶中，图3直链淀粉和支链淀粉紫外吸收光谱5α、β值的确定以及标准曲线的建立5.1α、β值的确定按照表1配置两组淀粉标准溶液，分别进行紫外全波段扫描和532nm处与641nm处吸光度值的测定。由测定的实验数据可得α平均值为0.4507，β平均值为0.4857。表1不同浓度淀粉标准溶液在532nm处与641nm处吸光度值A532A641A532A64112.00.03060.06370.48041315.00.06410.0290.452423.00.04710.09610.49011418.00.07570.03360.443935.00.07850.16110.48731520.00.08650.03880.448648.00.12560.25720.48831622.00.09580.04310.4499510.00.16540.34060.48561725.00.10830.04840.4469612.00.19050.39370.48391830.00.13230.05970.4512715.00.23710.4880.48591935.00.15380.06980.4538818.00.28350.5850.48462038.00.16750.07520.4490920.00.32080.66390.48322140.00.17960.08140.45321022.00.3470.7140.48602243.00.18660.08430.45181125.00.39630.81320.48732345.00.19950.09090.45561230.00.46960.96610.48612450.00.22160.10010.4517系列淀粉标准溶液的紫外全波段光谱如图4、图5：图4直链淀粉系列标准溶液紫外图谱图5支链淀粉系列标准溶液紫外图谱5.2标准曲线的绘制取7个100mL容量瓶，按照表2和表3分别配制直链淀粉和支链淀粉标准溶液，以浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。5.表2：直链淀粉标准曲线序号加入直链淀粉标准溶液（2.1.8浓度，mg/lA64110.22.00.0720.55.00.16231.010.00.335641.515.00.493652.020.00.668762.525.00.818873.030.00.9823拟合标准曲线为：R值：0.99995.表3：支链淀粉标准曲线序号加入支链淀粉标准溶液（2.1.9浓度，mg/lA53213.030.00.114224.040.00.155335.050.00.193346.060.00.233457.070.00.271668.080.00.308479.090.00.3412拟合标准曲线为：R值：0.99956稳定性试验取1个混合标准溶液，显色后在532nm波长条件下，每间隔10min检测吸光度，检测结果表明在30min内吸光度值基本稳定。表4：稳定性检测数据时间10min20min30min40min50min60min吸光度值0.65120.65100.65110.64800.64300.63897样品前处理与测定7.1样品的选取和制备挑选干净的高粱样品，用粉碎机粉碎，过80目筛，混匀后测定样品中的水分。7.2脱脂称取干燥后的样品放入索氏提取器中，加入甲醇30mL，加热回流脱脂4h，然后放入干燥箱中干燥，并测定样品中的粗脂肪含量。7.3样品分散精确称取0.1g脱脂后的干燥样品于100mL容量瓶中，加入1mL95%乙醇，充分湿润样品，再加入9mL1mol/L氢氧化钠溶液后7.4显色与测定吸取分散后的样液10mL于100mL容量瓶中，加水30mL，调节pH值为3.0，再加入碘试剂2mL，用水定容至刻度。显色10min后，于紫外分光光度计中测定532nm处和641nm处的吸光度值，同一样品平行测定5次，取平均值。7.5结果计算：直链淀粉：X=式中X——直链淀粉占样品干重的百分比，%；A641——样品溶液在641nm处的吸光度值；A532——样品溶液在532nm处的吸光度值；α——由实验计算出的常数；β——由实验计算出的常数；m——样品的质量，g；H——水分百分率；——样品粗脂肪含量。支链淀粉：X=式中X——支链淀粉占样品干重的百分比，%；A641——样品溶液在641nm处的吸光度值；A532——样品溶液在532nm处的吸光度值；α——由实验计算出的常数；β——由实验计算出的常数；m——样品的质量，g；H——水分百分率；——样品粗脂肪含量。8精密度试验精密称取0.1克左右高粱样品（按7.1和7.2进行样品制备）至100mL容量瓶中按7.3进行样品分散，再按7.4和7.5进行显色测定与计算，连续测量6次，计算其直链淀粉和支链淀粉的含量以及RSD值，具体结果如下：表5：精密度试验结果编号直链淀粉含量，%支链淀粉含量，%1#6.302460.64902#6.302260.64913#6.302560.64884#6.302060.64825#6.301960.64856#6.302160.6489RSD值，%0.00370.000569．重复性试验精密称取0.1克左右高粱样品（按7.1和7.2进行样品制备）至表6：重复性试验结果编号直链淀粉含量，%支链淀粉含量，%1#21.096161.43842#21.095861.43883#21.090661.43904#21.095561.43955#21.092361.43756#21.097061.4350RSD值，%0.0120.002710准确度试验10.1直链淀粉精密称取0.1克高粱样品（按7.1和7.2进行样品制备）至100mL容量瓶中按照7.3进行样品分散，按照表7添加直链淀粉标准溶液，再按照7.4和7.5进行显色测定，得到表7：直链淀粉准确度试验结果编号1#2#3#4#5#6#加样浓度，mg/L2.05.010.015.020.025.0测定浓度，mg/L1.91454.939.921914.716519.888624.3860回收率，%95.7398.7799.2298.1199.4497.5410.2支链淀粉精密称取0.1克高粱样品（按7.1和7.2进行样品制备）至100mL容量瓶中按照7.3进行样品分散，按表8添加支链淀粉标准溶液，再按照7.4和7.5进行显色测定，表8：支链淀粉准确度试验结果编号1#2#3#4#5#6#加样浓度，mg/L10.020.025.030.040.050.0测定浓度，mg/L10.224520.534523.354826.335334.538545.3612回收率，%102.25102.6793.4287.7886.3590.7211检测总结11.1直链淀粉和支链淀粉标准曲线：直链淀粉和支链淀粉分别在641nm和532nm处有最大的吸收峰，直链淀粉在2～30mg/L、支链淀粉在30～90mg/L有很好的线性关系。11.2精密度试验：同一显色后的样品溶液，分别在641nm和532nm处连续测定6次，6次实验结果的RSD值分别为0.0037%和0.00056%，说明仪器的精密度良好。11.3稳定性试验：在60min内每间隔10min测定1次，结果显示在30min内稳定性良好。11.4重复性试验：同一样品的直链淀粉和支链淀粉平行实验结果的RSD值分别为0.012%和0.0027%，说明重复性良好。11.5准确度试验：通过对同一高粱样品添加不同浓度的直链淀粉和支链淀粉标准溶液并进行测定，直链淀粉的加标回收率为95～100%左右，而支链淀粉的加标回收率在86～103%之间，说明准确度良好。11.6通过以上试验结果说