第六章 微生物的生长繁殖及其控制3

第六章微生物的生长繁殖及其控制第四节环境对生长的影响及生长的测定1、稀释平板计数法对样品进行适当稀释→单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖→肉眼可见的菌落→对菌落数目的计数推测样品中的微生物细胞数第四节环境对生长的影响及生长的测定2、涂布平板法使用较多的常规方法，但有时涂布不均匀！（一般0.2ml）同一稀释度三个以上重复,取平均值；每支移液管及涂布棒只能接触一个稀释度的菌液；每个平板上的菌落数目合适，便于准确计数；要求：每ml活菌数＝同一稀释度平均数×稀释倍数×5注意：要三个以上重复平板平均计数；不适合丝状菌3.显微镜直接计数法采用细菌计数板或血球计数板，显微镜下直接计数（计算一定容积里样品中微生物的数量）。每ml原液含菌数＝每小格平均菌数×400×1000×稀释倍数第四节环境对生长的影响及生长的测定显微镜直接计数法缺点：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；第四节环境对生长的影响及生长的测定以生物量为指标测定微生物的生长1、比浊法在一定波长下，测定菌悬液的光密度，以光密度(opticaldensity,即O.D.)表示菌量。注意：测量应在菌浓度与O.D.成正比的线性范围内，否则不准第四节环境对生长的影响及生长的测定2、重量法以干重、湿重直接衡量微生物群体的生物量；通过样品中蛋白质、核酸含量的测定间接推算微生物群体的生物量；测定多细胞及丝状真菌生长情况的有效方法第四节环境对生长的影响及生长的测定3、生理指标法呼吸强度耗氧量酶活性与其群体的规模成正相关生物热样品中微生物数量多或生长旺盛，这些指标愈明显，因此可以借助特定的仪器如瓦勃氏呼吸仪、微量量热计等设备来测定相应的指标。第四节环境对生长的影响及生长的测定

二、酵母的生长繁殖大多数酵母菌为单细胞，呈卵园形，其细胞直径常是细菌的10倍左右，宽约1-5μm，长约5-20μm。但各种酵母的形态、大小差别很大，同种酵母也因菌龄及环境的不同而有差异。

二、酵母的生长繁殖

酵母菌的繁殖方式多种多样，主要的方式归结为：无性繁殖：芽殖(budding)：酵母菌的主要繁殖方式，各属酵母菌裂殖(fission)：少数酵母，如裂殖酵母属酵母产生无性孢子：掷孢子(掷孢酵母属)；节孢子(地霉属)；厚垣孢子(白假丝酵母)

有性繁殖：形成子囊孢子(ascospore)进行有性繁殖。

二、酵母的生长繁殖—芽殖细胞壁的扩增：酿酒酵母在营养丰富和适宜条件下生长时，新合成的细胞壁物质通常在细胞的顶部插入，导致细胞壁的扩增，以容纳更多的原生质。出芽：当生长达到细胞的同等大小时，细胞向外凸起，形成一个芽，随之新合成的细胞壁物质不断地在芽与细胞之间的部位插入，导致芽不断长大，同时复制的核与原生质被导入芽内，最后在芽与细胞之间形成横隔壁，并与母细胞分离，产生一个新细胞。

二、酵母的生长繁殖—芽殖芽痕（budscar）：芽殖后，母细胞表面上留下一个园形突起的芽痕，在新产生的酵母细胞上留下一个蒂痕。母细胞继续生长再次向外凸起形成新的芽，但新的芽决不会在芽痕上产生。一个酵母细胞不可能无限地进行芽殖，可以通过细胞表面芽痕的数量大约可以估计细胞的年龄。

二、酵母的生长繁殖—裂殖细胞长到一定大小后，核分裂，细胞中产生一隔膜被一分为二，经断裂产生新的子细胞。

二、酵母的生长繁殖—无性孢子进行繁殖少数酵母菌产生无性孢子进行繁殖，如掷孢酵母产生的掷孢子，孢子被弹射出而得以繁殖。

二、酵母的生长繁殖酵母菌是以形成子囊和子囊孢子的方式进行有性繁殖的。在细胞内产生两种性质不同的四个单倍体细胞--子囊孢子，即两个a细胞和两个α细胞，分别可以产生a因子和α因子，它们分泌出来分别可以使对方的生长停止在染色体复制开始之前的阶段，这类因子被称为外激素(Pheromone)。在营养等条件适宜时，通过a因子与α因子的相互识别，使a细胞与α细胞相互接触，经质配、核配，最后融合成一个2倍体的合子细胞，进行生长并以芽殖的方式继续生长繁殖，第四节环境对生长的影响及生长的测定一、环境对微生物生长的影响影响微生物生长的主要因素有营养物质，水的活性，温度，pH和氧等。重点：环境影响微生物生长的主要因素有营养物质，水的活性，温度，pH和氧等。微生物生长的测定丝状真菌和酵母的生长繁殖的几种方式第五节微生物生长的控制抑制(Inhibition)：在亚致死剂量因子作用下导致微生物生长停止，但在移去这种因子后生长仍可以恢复的生物学现象。第五节微生物生长的控制死亡(Death)：在致死剂量因子或在亚致死剂量因子长时间作用下，导致微生物生长能力不可逆丧失，即使这种因子移去后生长仍不能恢复的生物学现象。第五节微生物生长的控制防腐(Antiseptsis)：防腐是在某些化学物质或物理因子作用下，能防止或抑制微生物生长的一种措施，它能防止食物腐败或防止其他物质霉变。例如日常生活中以干燥、低温、盐腌或糖渍等防腐方法是保藏食品(物)的主要方式。具有防腐作用的化学物质称为防腐剂。第五节微生物生长的控制消毒(Disinfection)：消毒是利用某种方法杀死或灭活物质或物体中所有病原微生物的一种措施，它可以起到防止感染或传播的作用。具有消毒作用的化学物质称为消毒剂(Disinfectant)，一般消毒剂在常用浓度下只能杀死微生物的营养体，对芽孢则无杀灭作用。第五节微生物生长的控制灭菌(Sterilization)：灭菌是指利用某种方法杀死物体中包括芽孢在内的所有微生物的一种措施。灭菌后的物体不再有可存活的微生物。第五节微生物生长的控制化疗(Chemotherapy)：指利用具有选择毒性的化学物质如磺胺、抗生素等对生物体内部被微生物感染的组织进行治疗，以杀死组织内的病原微生物，但对机体本身无毒害作用的治疗措施。一、控制微生物生长的化学物质1.抗微生物剂(Antimicrobialagent)是一类能够杀死微生物或抑制微生物生长的化学物质，这类物质可以是人工合成的，也可以是生物合成的天然产物。根据它们抗微生物的特性可分为：(1)抑菌剂(Bacteriostaticagent)(2)杀菌剂(Bactericide)(3)溶菌剂(Bacteriolysis)一、控制微生物生长的化学物质(1)抑菌剂(Bacteriostaticagent)抑制微生物生长而不能杀死作用机理是这类物质结合到核糖体上抑制蛋白质合成，导致生长停止。由于它们同核糖体结合不紧，它们在浓度降低时又会游离出来，核糖体合成蛋白质的能力恢复，使生长恢复；一、控制微生物生长的化学物质(2)杀菌剂(Bactericide)它们能杀死细胞，但不能使细胞裂解，由于它们是紧紧地结合到细胞的作用靶上，即使在浓度降低时也不能游离出来，因此生长不能恢复；一、控制微生物生长的化学物质(3)溶菌剂(Bacteriolysis)通过诱导细胞裂解的方式杀死细胞，将这类物质加到生长的细胞悬液里以后会导致细胞数量或细胞悬液的混浊度降低。能抑制细胞壁合成或损伤细胞质膜的抗生素就属于溶菌剂。一、控制微生物生长的化学物质消毒剂(Disinfectant)用来杀死非生物材料上的微生物；防腐剂(Antisepsis)具有杀死微生物或抑制微生物生长的能力，但对于动物或人体的组织无毒害作用。甲醛、石碳酸(酚)、高锰酸钾、过氧乙酸、碘液、季铵盐、含氯化合物、叠氮钠等。一、控制微生物生长的化学物质2.抗代谢物利用生长因子的结构类似物干扰机体的正常代谢，以达到抑制微生物生长的目的。因此生长因子的结构类似物又称为抗代谢物(antimetabolite)，它在治疗由病毒和微生物引起的疾病上起着重要作用。例如磺胺类药物是叶酸组成部分对氨基苯甲酸的结构类似物，磺胺类药物被微生物吸收后取代对氨基苯甲酸，干扰叶酸的合成，抑制了转甲基反应，导致代谢的紊乱，从而抑制生长。一、控制微生物生长的化学物质3.抗生素(antibiotic)由某些生物合成或半合成的一类次级代谢产物或衍生物，它们能抑制微生物生长或杀死它们的化合物，它们主要是通过抑制细菌细胞壁合成、破坏细胞质膜、作用于呼吸链以干扰氧化磷酸化、抑制蛋白质和核酸合成等方式来抑制微生物的生长或杀死它们。图6-14扼要说明了作用于细菌的一些抗生素及其它们作用的主要部位。

Thespreadingofantibiotic-resistantbacteriaarethreateningourlives!经典的细菌性疾病新发再发的细菌性疾病人兽共患细菌性疾病条件致病菌造成的感染食源性细菌性食物中毒医源性细菌感染细菌性感染和疾病呈上升趋势，对人、兽造成的危害日趋严重!ModesofAntimicrobialAction

细菌耐药性的形成是细菌性感染日趋严重的源动力!如何克服细菌的耐药性是当前的研究重点和热点！AntibioticssensitiveAntibioticsresistanceAntibioticsAntibioticabuseincreasingtheantibioticresistanceAntibioticResistance:AComplexProblemInMedicine只要给予足够的时间，耐药性就会形成，没有一种抗生素最终不会产生耐药性！Resistanceisprogressivelyevolving

，fromlowlevelsthroughintermediatetohighlevels.IncreasingMICsareamarkerforfutureAntibioticResistance。耐药菌核蛋白体30S亚基中蛋白质结构发生改变，致使链霉素、卡那霉素等不能抑制蛋白质合成而产生耐药。RNA聚合酶β-亚基发生变化，使核心酶不能与利福霉素结合，降低了对抗生素的敏感性。耐药菌株的青霉素结合蛋白（PBP）发生结构改变，使药物不能识别，从而不能干扰细胞壁肽聚糖的合成。细菌药物作用靶位结构发生变化，药物不能正常识别靶点并与之结合来发挥抑杀作用。AlterationofAntibioticstargetsiteAAAAAAAAAAAPreventionofpenetrationofAntibiotics病原菌外膜蛋白改变导致细胞外膜通透性降低，阻碍抗生素进入内膜靶位，减少抗生素的吸收，一般来说，通透性的改变只是导致低水平的耐药性。对四环素耐药的细菌是由于四环素转运系统被抑制，阻止药物进入；对喹诺酮类药物耐药则是细菌的特异性孔道蛋白的表达减少，减少药物的渗入；外排系统的生理功能可能是保护细胞免受外来毒性物质损害或排出对自身有害的代谢产物。多数细菌可以通过获得、增强外输泵的方式产生耐药。在E.coli发现存在Ecr、EmrE、EmrAB、EmrD、QacE、AcrAB、AcrEF等外输泵。一般认为AcrAB是最主要的外输泵，属RND家族，可引起包括四环素、氯霉素、萘啶酸、氨苄西林、利福平、氟喹诺酮等多种制剂的耐药性。RapidexffluentionoftheantibioticsAAAAAAA例如：β-内酰胺酶、氨基糖苷类抗菌药物钝化酶、MSL类钝化酶（红霉素钝化酶、林可霉素钝化酶）……EnzymaticdestructionofantibioticsNaturalmetabolicpathway某些菌株产生耐药性主要是由于对抗菌药物抑制的代谢途径形成替代途径,例如对TMP的耐药。Alternativemetabolicpathway+Alternativemetabolicpathway细菌吸附于机体粘膜或插管、人工关节等生物医学材料表面，分泌多糖基质、纤维蛋白、脂多糖等多糖复合物，相互粘连并克隆产生的生物被膜（Biofilm）。Biofilmforming生物被膜形成耐药的机制：生物被膜的屏障作用;细菌生长缓慢与应激反应;传感效应（quorumsensing）;诱导产生生物被膜特异型。

有人提出细菌在粘附并聚集时,可能被诱导产生一种膜特异型，识别在膜内被激活或抑制的基因，对抗抗生素的杀伤作用。BiofilmonIntravenousCatheterConnecter24HoursAfterInsertion2.细菌耐药性的特点The

Characterizations

of

the

Bacterial

Antibiotic-resistance青霉素--1939年起批量生产，1943年就有耐药菌出现。诺氟沙星--

1984年上市不久，美、法、德、日、韩、荷等相继报道了其耐药大肠杆菌出现。喹诺酮类--进入我国仅20多年，耐药率已达到60%—70%，在兽医临床其耐药率甚至可达到90%。现在，有的药物还没有使用或刚刚使用已经出现耐药菌。2.1耐药性形成的速度越来越快耐药菌产生后，很快从一个地域传向其它地域，不但能够在同种细菌间进行耐药性传递，还可以在不同种的细菌间进行传递,使未曾用药的个体或地区也出现耐药菌株。由于耐药性的广泛传播，病原菌的耐药率呈现逐年上升的趋势。例如临床分离的各种细菌对喹诺酮类药物的耐药率达50%，而且呈逐年上升的趋势。2.2耐药性传播的速度越来越快耐药菌对大多数喹诺酮类药物的MIC值高于敏感菌的

4～8倍，也有资料显示由于药物对病原菌的选择压力，大部分耐药菌株的MIC值高于敏感株的25倍以上，最高的达1000倍。敏感菌株的MIC一般为0.2µg/ml，而我室在动物源性大肠杆菌耐药性监测中分离到耐氧氟沙星菌株的MIC为256µg/ml。2.3耐药强度越来越高随着药物种类的增加，单一耐药谱型少见，出现了同时耐2种以上结构不相关药物的耐药菌株。我室自1996年以来对146株猪、鸡大肠杆菌耐药性监测显示，所有菌株都具有不同程度的耐药性，最少耐3种药物，最多为15种，平均达7种。1994年英国的药学杂志报导，已有研究人员在病人样品中发现了可以抵抗现有全部抗生素的“超级耐药菌”。现已发现至少3种能够导致严重威胁生命疾病的病菌--粪肠球菌、结核分枝杆菌、铜绿假单胞菌，可耐受100多种抗生素。2.4耐药谱越来越广Transferofantibioticresistance

betweenanimalsandhumansEnvironmentDirectcontact

开发一种新的抗生素一般需要10年左右的时间，而一代耐药菌的产生只要2年的时间，抗生素的研制速度远远赶不上耐药菌出现的速度。我国是世界上滥用抗生素最为严重的国家之一，耐药菌引起的医院感染人数已占到住院感染患者总人数的30%左右。我国有可能率先进入“后抗生素时代”，亦即回到抗生素发现之前的黑暗时代，严格控制抗生素的使用已经刻不容缓！TheEmergenceofaBacteriaResistanttoAllAntibioticsHeraldtheEndoftheEraofAntibiotics!Antibiotic

Resistance:AGlobalproblemFDA/CVM(retailmeatandpoultry)CDC(humans)USDA(animal/slaughter)TheNationalAntimicrobialResistanceMonitoringSystem(NARMS)ItismoreconvenienttogetagunthanasingledoseofantibioticinUSATheEuropeanAntimicrobialResistanceSurveillanceSystem

(EARSS)

EARSSisaEuropeanwidenetworkofnationalsurveillancesystems,providingreferencedataonantimicrobialresistanceforpublichealthpurposes.Itprovidetimelyinformationfornationalhealth-carepolicydecisions,keeppolicymakers,scientists,doctorsandthepublicinformedabouttrendsindrugresistance

ThenetworkreceivesfundingfromtheEuropeanCommission’sDirectorate-GeneralforHealthandConsumerAffairs(DGSANCO).

EARSSisamajorpartnerin

theWHOglobalstrategyforworldwidesurveillanceofdrugresistance.EARSSTheFocalPointsoftheAntibioticResistanceMechanismsofresistanceStandardtreatmentguidelinesfordiseasemanagementFactorscontributingtothespreadofresistanceTheprevalenceantibioticresistanceofinfectionsinthecommunityStrategiesforimprovingtreatmentandevaluationofnewtreatmentalternatives

抗生素在临床上使用时一定要注意：(1)第一次使用的药物剂量要足；(2)避免在一个时期或长期多次使用同种抗生素；(3)不同的抗生素(或与其他药物)混合使用；(4)对现有抗生素进行改造或(5)筛选新的更有效的抗生素，这样既可以提高治疗效果，又不会使细菌产生抗药性。二、控制微生物的物理因素1.高温灭菌十倍致死时间(Decimalreductiontime，D)，即在一定的温度条件下，微生物数量十倍减少所需要的时间,是衡量灭菌效果的指标之一，温度愈高，十倍致死时间愈短。D值大小还随微生物的种类、生长时期、检测培养基的性质等因素有关。热致死时间(Thermaldeathtime)，即在一定温度下杀死所有某一浓度微生物所需要的时间。待测样品中的微生物数量大，杀死所有微生物所需的时间比杀死微生物浓度低的样品所需的时间长。当微生物的浓度一致时，可以通过比较热致死时间长短来衡量不同微生物的热敏感性。二、控制微生物的物理因素孢子的抗热性远远大于营养体的抗热性。例如在高压蒸汽灭菌(121℃)时，内生孢子的十倍减少时间需要4-5分钟，而营养体在65℃的十倍减少时间只需0.1-0.5分钟。培养基经高压蒸汽灭菌时，灭菌的效果同培养基的性质有关。例如酸性食品土豆、果汁、泡菜等比中性食品大米、豆制品等更容易灭菌。高浓度的糖、蛋白质和脂类能降低热穿透性，因而它们常是增加机体对热的抗性；盐浓度高不是增加就是减少机体的抗热性，这主要取决于微生物的状态。干细胞比湿细胞有更大的抗热性，它们的灭菌需要更高的灭菌温度或更长的时间。干热灭菌法—焚烧：废弃物、尸体灼烧：接种环、试管口干烤：玻璃器皿红外线：医疗器械湿热灭菌法—巴氏消毒法煮沸法流动蒸汽消毒法间歇蒸汽消毒法高压蒸汽灭菌法

热力灭菌法巴氏消毒法具体方法有三种低温维持巴氏消毒法（LTH）63-65℃30min；高温瞬时巴氏消毒法(HTST)71-72℃15s；超高温巴氏消毒法(UHT)132℃1-2s。消毒后均须迅速冷却至10℃以下，促进细菌死亡，称为冷击法。超高温巴氏消毒的鲜乳在常温下，保存期可达6个月。流通蒸汽灭菌法是利用蒸汽在流通蒸汽灭菌器内进行灭菌的方法，100℃维持30min。间歇灭菌法：100℃维持30min，37℃温箱过夜，连续进行3次灭菌和2次保温，达到完全灭菌目的。用于不耐高温的培养基的灭菌。

热力灭菌法二、控制微生物的物理因素高压蒸汽灭菌法即用高压蒸汽灭菌器进行灭菌的方法。是应用最广、最有效的灭菌方法。原理给高压蒸汽灭菌器加水、放入被灭菌物品、密闭、加热，蒸汽产生压力，随压力的增大水的沸点升高，温度也升至100℃以上，以提高灭菌的效果，缩短灭菌时间。灭菌条件常用1.02kg／cm2（每平方英寸15磅）的压力，在12l.3℃温度下，维持15-20min，即可杀死所有微生物，达到完全灭菌的目的。常用于如培养基、溶液、器皿、器械、敷料、橡皮手套、工作服和小实验动物尸体等的灭菌。灭菌注意须充分排除灭菌器内原有的冷空气。干热灭菌法—焚烧：废弃物、尸体灼烧：接种环、试管口干烤：玻璃器皿红外线：医疗器械湿热灭菌法—巴氏消毒法：61.6-62.8℃30min或71.7℃15-30s,主要用于牛乳消毒。煮沸法流动蒸汽消毒法间歇蒸汽消毒法高压蒸汽灭菌法

热力灭菌法二、控制微生物的物理因素2.辐射作用辐射灭菌(radiationsterilization)是利用电磁辐射产生的电磁波杀死大多数物质上的微生