抗生素发酵工程

关于抗生素发酵工程第1页，共39页，2022年，5月20日，21点54分，星期四第一节抗生素概论一、抗生素的定义传统的定义：抗生素（antibiotic）是微生物细胞产生的能以低浓度抑制其他微生物细胞生长的化学物质。现代定义：抗生素是生物细胞产生的能以低浓度抑制其他生物细胞生长或功能的化学物质抗生素与药理活性物质的区别：药理活性物质作用于动植物体本身的生理功能（如免疫调节、降血脂、降血糖、降血压、抗炎、减肥、动植物生长促进、植物生长抑制等等）抗生素作用于动植物体内的寄生（或赘生）生物（细菌、真菌、病毒、癌细胞等）第2页，共39页，2022年，5月20日，21点54分，星期四

据世界卫生组织(WHO)1999年统计，全世界每年有1400万人死于感染病，占死亡人数的第一位，其次是心脏病、癌症和脑疾病，分别为750万人、700万人和550万人。一种新的抗生素研制的费用大约需要十几亿美金和10到15年的过程，而使用不当，3到5年病菌就会对这种药物产生耐药性。我国的金黄色葡萄球菌的耐青霉素比例已经高达90%，造成肺炎的病菌在社区的标本有20%可以耐药，而在医院内这一比例可以达到60%。肺炎链球菌已有45%耐青霉素，70%耐红霉素。第3页，共39页，2022年，5月20日，21点54分，星期四二、青霉素的发现者及1945年诺贝尔生理学医学奖获得者AlexanderFleming(1881-1955)B.

Chain(1906-1979)W.

Florey(1898-1968)返回第4页，共39页，2022年，5月20日，21点54分，星期四三、微生物产生抗生素1、放线菌产生的抗生素：链霉菌属：放线菌素、链霉素等60％种类。小单抱菌属：红霉素（大环内酯类）、新霉素（氨基环醇类）诺卡氏菌属：肌霉素（氨基环醇类）、诺卡氏菌素第5页，共39页，2022年，5月20日，21点54分，星期四2、细菌产生抗生素芽孢杆菌属：多粘芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌假单胞菌属：铜绿假单胞菌（绿脓杆菌）杆菌肽、粘杆菌素、多黏菌素等多肽类。3、真菌产生抗生素青霉属：青霉素、灰黄霉素。头孢菌属：头孢霉素第6页，共39页，2022年，5月20日，21点54分，星期四四、抗生素的分类（一）类亚类主要品种b-内酰胺类(b-Lactams)青霉素类头孢烯类氧头孢烯类碳头孢烯类青霉烯类碳青霉烯类单环内酰胺类-内酰胺酶抑制剂青霉素G，青霉素V，氨苄西林，阿莫西林，······头孢噻吩，头孢唑啉，头孢氨苄，头孢羟氨苄，······拉氧头孢，氟氧头孢氯碳头孢瑞替配能，法罗配能亚胺配能，帕尼配能，美洛配能，比阿配能氨曲喃，卡鲁莫喃棒酸，舒巴坦，三唑巴坦，舒他西林，三唑配能第7页，共39页，2022年，5月20日，21点54分，星期四HNONSCH3CH3HCOO-H-lactamringβ-内酰胺环R第8页，共39页，2022年，5月20日，21点54分，星期四抗生素的分类（二）类亚类主要品种氨基糖苷类(Amino-glycosides)天然半合成链霉素，卡那霉素，庆大米星(庆大霉素)，小诺米星(小诺霉素)，核糖霉素，妥布霉素，紫苏霉素，阿斯米星(福提霉素)，大观霉素，新霉素，春日霉素，有效霉素半合成卡那霉素：阿贝卡星，阿米卡星，地贝卡星；半合成紫苏霉素：奈替米星；半合成庆大霉素：衣替米星第9页，共39页，2022年，5月20日，21点54分，星期四抗生素的分类（三）类亚类主要品种大环内酯类(Macro-lactones)14员环15员环16员环>20员红霉素，竹桃霉素，半合成红霉素克拉霉素、罗红霉素、地红霉素、氟红霉素阿齐霉素(半合成红霉素)柱晶白霉素(北里霉素)，交沙霉素，麦迪霉素，罗他霉素(丙酰柱晶白霉素)，乙酰螺旋霉素和丙酰螺旋霉素(半合成螺旋霉素)，三冈霉素(半合成麦迪霉素)，泰洛菌素，除虫菌素，双氢除虫菌素(半合成除虫菌素)，环氧噻酮藤霉素(他克莫司)，雷帕霉素(昔洛莫司)第10页，共39页，2022年，5月20日，21点54分，星期四

红霉素A克拉霉素罗红霉素氟红霉素

R1H

CH3H

HR2

O

O

NOCH2O(CH2)2OCH3

OR3H

H

HF第11页，共39页，2022年，5月20日，21点54分，星期四抗生素的分类（四）类亚类主要品种四环素类(Tetra-cyclines)天然半合成四环素，土霉素，金霉素，去甲基金霉素脱氧土霉素(多西环素)，甲烯土霉素(米他环素)，二甲胺四环素(米诺环素)多肽类(peptides)杆菌肽，短杆菌肽S，多粘菌素B，粘杆菌素，卷曲霉素，结核放线菌素，丝裂霉素，环孢素(环孢菌素)，古斯莫司，乌苯美司，二丙膦第12页，共39页，2022年，5月20日，21点54分，星期四作用机制（一）作用机制抗生素主要作用靶位抑制细菌细胞壁肽聚糖生物合成-内酰胺类磷霉素糖肽类环丝氨酸杆菌肽抑制转肽酶活性，破坏肽聚糖相互交联和肽聚糖生物合成中的UDP-N-乙酰葡糖胺丙酮酰转移酶结合，阻断UDP-N-乙酰葡糖胺向UDP-N-乙酰胞壁酸的转化与D-丙氨酰-D-丙氨酸结合，抑制转糖基和转肽反应抑制丙氨酸消旋酶和D-丙氨酰-D-丙氨酸合成酶抑制焦磷酸酶，阻断肽聚糖跨膜载体十一聚异戊二烯醇再生第13页，共39页，2022年，5月20日，21点54分，星期四作用机制（二）作用机制抗生素主要作用靶位破坏微生物细胞质膜功能多烯类唑类抗真菌药物托萘酯(发癣退)多粘菌素B,粘杆菌素短杆菌肽S脂肽类(Daptomycin)与组成真菌细胞膜的麦角固醇结合而破坏膜功能抑制真菌羊毛固醇脱甲基酶(细胞色素P-450)，阻断麦角固醇合成抑制真菌角鲨烯单加氧酶类似阳离子洗涤剂的作用，破坏细菌细胞膜的磷脂结构切断细菌电子传递系统与氧化磷酸化的偶联与G(+)细菌的脂磷壁酸结合，使细胞质膜去极化，从而破坏膜的传输功能第14页，共39页，2022年，5月20日，21点54分，星期四作用机制（三）作用机制抗生素主要作用靶位抑制蛋白质生物合成氨基糖苷类四环素类氯霉素、林肯霉素和大环内酯类春日霉素卷曲霉素噁唑烷二酮类与核糖体30S亚基和50S亚基结合，抑制肽酰-tRNA转位与30S亚基结合，抑制氨基脂酰基-tRNA与mRNA密码子依赖性核糖体A位结合作用于50S亚基中的23S核蛋白体RNA(rRNA)，抑制肽酰基转移酶抑制30S亚基与甲酰蛋氨酸-tRNA复合物的形成与30S及50S亚基结合，抑制蛋白质合成的开始阶段和延长过程的转位与50S亚基的23SrRNA结合，干扰70S功能起始复合物的形成第15页，共39页，2022年，5月20日，21点54分，星期四作用机制（四）作用机制抗生素主要作用靶位抑制DNA生物合成磺胺类甲氧苄啶,氨甲蝶呤,氨基蝶呤丝裂霉素C博来霉素萘啶酸，奎诺酮类，新生霉素抑制细菌二氢叶酸合成酶抑制细菌二氢叶酸还原酶抑制DNA复制时的双链打开与DNA结合，切断DNA的一条链抑制细菌DNA促旋酶(拓扑异构酶)抑制RNA生物合成桑吉霉素，丰加霉素放线菌素D蒽环类利福霉素类抑制转录反应抑制DNA依赖性RNA聚合酶抑制DNA依赖性RNA和DNA聚合酶抑制细菌DNA依赖性RNA聚合酶第16页，共39页，2022年，5月20日，21点54分，星期四作用机制（五）作用机制抗生素主要作用靶位作用于细胞内的阳离子离子载体类抗生素(莫能菌素、盐霉素等聚醚类，二、三、四抗菌素等大环四内酯类，缬氨霉素、白僵菌素等肽类抗生素)与细胞膜中的Na+、K+、Ag+、Ca2+等金属离子形成稳定的螯合物，影响细胞膜的离子透过性，打乱细胞内的离子分布，使细胞失去正常功能抑制有丝分裂灰黄霉素，长春花生物碱与微管蛋白结合，干扰有丝分裂纺锤体的形成。第17页，共39页，2022年，5月20日，21点54分，星期四作用机制（六）作用机制抗生素主要作用靶位抑制能量代谢抗霉素A，杀稻瘟菌素S，干蠕孢菌素阻碍呼吸链的电子传递，抑制ATP合成酶拮抗神经传递物质除虫菌素，双氢除虫菌素拮抗线形动物和节足动物的神经传递物质-氨基丁酸，使细胞神经麻痹，直至死亡第18页，共39页，2022年，5月20日，21点54分，星期四五、抗生素产生菌的选育1、抗生素产生菌的分离2、抗菌性试验3、抗生素产生菌的改良(1)人工诱变(2)原生质体融合第19页，共39页，2022年，5月20日，21点54分，星期四(3)体外DNA重组

克隆第20页，共39页，2022年，5月20日，21点54分，星期四六、抗生素的提纯

微生物在发酵过程中会产生多种代谢产物，包括各种初级代谢产物和次级代谢产物以及培养基的固有成分，这些成分的存在影响抗生素的使用效果，本身具有毒副作用，造成储存困难，必须经过精制。第21页，共39页，2022年，5月20日，21点54分，星期四⑴抗生素提纯的基本步骤和原则3个基本步骤：发酵液过滤和预处理、粗纯化、精制4个原则：时间尽量短；采用适当较低浓度；条件适宜，pH适度，温度适宜；防止杂菌污染。⑵提取方法：吸附、萃取、离子交换、沉淀⑶色谱分离、分子筛过滤、透析等等第22页，共39页，2022年，5月20日，21点54分，星期四第二节青霉素的发酵工艺第23页，共39页，2022年，5月20日，21点54分，星期四1、青霉素的产生菌作为第一个具有临床应用价值的抗生素，1928年被发现，1943年在美国被首次实现工业生产。点青霉的发酵单位很低2U/mL，目前国际上青霉素生产最高发酵单位80000-90000U/mL.生产菌种按其在深层培养中菌丝形态分为：丝状菌和球状菌。黄孢子丝状菌绿孢子丝状菌第24页，共39页，2022年，5月20日，21点54分，星期四2、青霉素的作用机制、抗菌谱及稳定性(1)作用机制：抑制细菌的转肽酶，阻止细胞壁合成中的交叉连接步骤，使处于繁殖分裂期的细菌细胞壁的合成发生障碍，导致菌体细胞壁损坏，使细胞内因渗透压等原因发生溶解而死亡。(2)抗菌谱：作用于大多数革兰氏阳性细菌及部分革兰氏阴性细菌。(3)稳定性：弱酸性的有机化合物，干燥纯净的青霉素盐很稳定，pH5-7，6最稳定。第25页，共39页，2022年，5月20日，21点54分，星期四5、青霉素发酵工艺流程及发酵控制青霉素发酵培养流程第26页，共39页，2022年，5月20日，21点54分，星期四(1)培养基的成分组成和配比对菌体生长发育、发酵单位及质量C源：碳水化合物，葡萄糖、乳糖N源：玉米浆、黄豆粉；硝酸铵、氯化铵无机盐：各种离子前体物质：苯乙胺、苯乙酸(2)发酵工艺控制：二级发酵，菌龄、特性、生长环境(3)补料及控制：糖、硫酸铵、苯乙酸、氨水、玉米油(4)发酵温度、pH及通气搅拌的控制：温度：26-27℃，pH:6.6-6.9，通气搅拌：1：0.95第27页，共39页，2022年，5月20日，21点54分，星期四(5)青霉素的提取发酵液预处理→萃取→脱色→反萃取→过滤洗涤→干燥①发酵液预处理：A加热使蛋白质变性沉淀；B加絮凝剂使蛋白质沉淀C固液分离离心②萃取工艺过程：二级逆流萃取第28页，共39页，2022年，5月20日，21点54分，星期四A、萃取目的：杂质多，含量少。原理：分配定律，青霉素G在水中溶解度小，易溶于醋酸丁酯、醇等有机溶剂中，青霉素盐易溶于水，不溶于有机溶剂。青霉素在滤液中以盐存在，加入酸和醋酸丁酯，溶于有机相中，在醋酸丁酯中加入碳酸钾，6.2-7.2，形成盐转入水相中，实现反萃取。第29页，共39页，2022年，5月20日，21点54分，星期四B、影响萃取因素a、pH：反复调节pH，青霉素不稳定，易发生降解、异构化、重排，β-内酰胺环是功能性。b、温度：加热会加快其降解反应c、工艺过程及浓缩倍数，级数越高、纯度越高但收率越低。d、微生物污染：杂菌：β-内酰胺酶和青霉素酰胺酶e、萃取时间：青霉素在水中的半衰期18.5min。第30页，共39页，2022年，5月20日，21点54分，星期四6、青霉素的精制制成碱金属盐：碱金属盐稳定性大；青霉素在水中的稳定性差，水解快。(1)结晶工艺：A、醋酸丁酯中直接结晶：加入醋酸钾-乙醇----碳酸钾、丁醇-水真空共沸蒸馏。B、丁醇-水共沸结晶：青霉素的碱金属盐溶于水，在丁醇中不溶解，稳定，丁醇和水形成二元共沸物蒸出，丁醇带出水分，不断加入丁醇，可使水分不断减少，结晶析出。第31页，共39页，2022年，5月20日，21点54分，星期四(2)过滤、洗涤、干燥结晶后用真空抽滤来处理母液，并用丁醇洗涤。干燥采用真空双锥旋转干燥器，7、溶媒回收采用立式传质塔蒸馏回收。第32页，共39页，2022年，5月20日，21点54分，星期四一、斜面培养：淀粉1％，硫酸铵0.3％、玉米粉0.6～1.0％、氯化钠0.3％、蛋白胨0.2％、琼脂2％、pH7.0～7.237℃培养7～10d，成熟的孢子灰色略带微红色。一级种子培养：豆饼粉2.5％、葡萄糖3％、淀粉4％、蛋白胨0.5％、酵母粉0.5％、硫酸铵0.5％、％、玉米粉0.2％、氯化钠0.3％、磷酸氢二钾0.06％、硫酸镁0.025％、豆油0.3％35℃培养72h，菌丝密集红霉素的发酵生产第33页，共39页，2022年，5月20日，21点54分，星期四二级种子：豆饼粉2.2％、葡萄糖3％、淀粉4％、蛋白胨0.5％、酵母粉0.5％、硫酸铵0.1％、玉米粉0.8％、氯化钠0.3％、碳酸钙0.6％、豆油0.3％35℃，24h，接种量10％二、发酵罐培养发酵培养基：豆饼粉2.4％、葡萄糖3％、3.5％、蛋白胨0.5％、酵母粉0.5％、硫酸铵0.1％、玉米粉0.8％、氯化钠0.3％、碳酸钙0.6％、豆油0.15％，丙酸0.6％（分次加入）60h前35℃，60h后33℃第3