实验三微生物染色观察

1、一 油镜的使用学习油镜的使用技术及维护的基本知识初步认识细菌的基本形态实验目的第一页，共二十三页。油镜使用的原理 油浸接物镜。当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。浸没油与玻璃的折射率相近很多原来由于在透镜及载片表面的反射和折射而损失的 光线可以进入物镜，使照明亮度提高，改善观察效果。第二页，共二十三页。1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度3.观察标本时，

2、必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。4.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。5.显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片。显微镜保养和使用中的注意事项第三页，共二十三页。操作步骤现场演示1.低倍镜观察：粗调、细调。依次再进行中倍、高倍观察2.油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。3.换片：另换新片，必须从第1条开始操作。4.用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯

3、擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部复原。注意：油镜使用完毕后一定要用二甲苯擦拭镜头用油镜观察细菌三形永久装片。第四页，共二十三页。 简单染色是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。 常用碱性染料进行简单染色，因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色，经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。实验原理二 细菌的简单染色第五页，共二十三页。 常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。 当细菌分解糖类产酸使培

4、养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。实验原理 (continued) 细菌细胞微小，透明，不易观察，需染上颜色。利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。第六页，共二十三页。1、菌种枯草芽孢杆菌1D培养物2、染色剂吕氏碱性美蓝染液齐氏石碳酸复红染液实验材料 第七页，共二十三页。涂片干燥 固定染色水洗干燥镜检操作步骤 四、实验步骤无菌操作第八页，共二十三页。菌悬液涂片干燥滴加无菌水固定取菌苔涂片操作步骤（continued） 第九页，共二十三页。1、涂片 取两块载玻片，各滴一小滴（或用接种环沾

5、取）生理盐水（或无菌水）于玻片中央，用接种环以无菌操作分别从枯草杆菌和金黄色葡萄球菌斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混合并涂成薄膜。 如用菌悬液或液体培养物，可用接种环挑取1-2环直接涂于载玻片上。 Notes: 1） 载玻片要洁净无油迹 2）滴生理盐水和取菌不宜过多 3）涂片要涂抹均匀，不宜过厚。操作步骤（continued） 第十页，共二十三页。3、固定固定的目的：1）使细胞质凝固，以固定细胞形态；2）并使菌体牢固地附着在载玻片上。固定方法：热固定：涂面朝上，通过火焰数次注意：温度不宜过高，以玻片背面不烫手为宜，否则会改变甚至破坏细胞形态操作步骤（continued） 2、干燥 室温自然干燥第

6、十一页，共二十三页。4、染色 将玻片平放于玻片搁架上，滴加染液于涂片上（染液刚好覆盖涂片薄膜为宜）。 美蓝染色1-2min；石碳酸复红染色约1min。操作步骤（continued） 5、水洗倒去染液，用洗瓶（内装自来水）轻轻冲洗，直至涂片上流下来的水无色为止；染色废液收集在废液缸中。Note: 水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端流下，水流不宜过急，以免涂片薄膜脱落。第十二页，共二十三页。7、镜检 细菌个体微小，一般使用油镜观察细菌个体形态。操作步骤（continued） 6、干燥自然干燥或用电吹风吹干，也可用吸水纸吸干。第十三页，共二十三页。7、镜检（continued）Note

7、s: 必须等涂片完全干后才可滴加香柏油油镜使用完毕，切记按规定步骤擦干净，否则可能损害镜头3）擦油镜镜头方法：分三步 A）先用擦镜纸揩去镜头上的香柏油 B）从双层瓶的下层沾少许二甲苯滴在另一片擦镜纸上 ，擦拭镜头； C）再用一小片擦镜纸擦去镜头上可能残留的二甲苯。操作步骤（continued） 第十四页，共二十三页。三 革兰氏染色单染色法：只能观察微生物的大小、形状、和细胞排列状况，但不能鉴别微生物以及它的特殊构造等。复染色法：用两种或两种以上染色液进行染色，有协助鉴别微生物的作用，故也称鉴别染色法。常用的有：革兰氏染色法、抗酸染色法、芽孢染色法、荚膜染色法等。第十五页，共二十三页。革兰氏染色

8、（Gram stain） 1984年，丹麦医生Gram采用革兰氏染色法细菌细胞壁区分为两种类型：革兰氏阴性（G+）和革兰氏阳性（G-）革兰氏染色步骤: 1）结晶紫初染；2）碘液媒染； 3）酒精脱色； 4）番红复染第十六页，共二十三页。 G菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性屏障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。G菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，番红复染后呈红色。革兰氏染色的实验原理第十七页，共二十三页。细菌的特殊形态结构芽孢：休眠体，不利环境下产生，耐受各种极端

9、环境。荚膜：多糖，包裹在菌体外围，保护菌体鞭毛：运动，菌落形态。第十八页，共二十三页。实验材料大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌（2 day培养物）革兰氏染色液一套第十九页，共二十三页。实验步骤革兰氏染色枯草杆菌的芽孢染色绘图、写实验报告第二十页，共二十三页。革兰氏染色的步骤1. 涂片2. 初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。3. 媒染：先用新配的路哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。4. 脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约1520秒，后立即用流水冲洗。5. 复染：滴加番红染色液，染35分钟，水洗后用吸水纸吸干。 6. 镜检：观察染色结果并绘图。第二十一页，共二十三页。Figure 1 - A Gram stain of Gram + Staphylococcus cells. Figure 2 - Gram stain of Gram E. coli cells第二十二页，共二十三页。四 芽孢的染色1、制备菌液：加2-4滴蒸馏水于小试管中，用接种环从斜面挑取菌体2环于试管中充分混匀。2、加染色液：加孔雀