常规组织病理技术课件

1、常规组织病理技术病理学教研室谢贤镛概述 高、新技术在病理领域的运用只能拓宽病理工作者的视野，丰富病理研究工作的内容，在一定程度上提高疾病诊断的准确性。病理工作最基本、最重要的技术仍然是常规组织病理技术，离开它，一切病理诊断和研究都无从谈起。 第一节 组织与细胞的取材 一张好的切片与组织取材、固定、染色有密切的关系。正确的取材、合适的固定和良好的染色是优质病理工作的基础。 为适应新技术的开展，要求所需材料，不仅要组织细胞的形态完整保存；而且要最大限度保存组织或细胞成分的抗原性；还要求抗原不弥散，以保证其准确定位。这就为取材和固定提出了更高要求。 一、组织取材 （一）一般原则 1、厚度 0.20.

2、3cm；面积 1 1.5cm2。 2、皮肤、腔道器官及囊壁组织等应 剪成 细条，如过长可将其缠绕成 同心圆状。 （二）、取材注意事项 1、刀剪应锋利、避免前后拉动和 挤压。 2、避免使用有齿镊，动作轻柔以 免挫伤或挤压组织。 3、应避开坏死组织和血凝块，去掉 异物。4、应取病变主体、病变与正常交界 和正常组织各一块。4、活细胞标本制备：将细胞直接培养 在盖玻片上（细胞爬片），或培养 于培养瓶或培养板内，制成细胞悬 液，再涂片。 第二节 固定及常用固定剂一、概念：将组织浸入某些化学试 剂，使细胞内的物质能尽量保 持其生活状态时的形态结构和 位置，这 一过程称之。二、固定的作用 1、保持组织、细胞

3、与生活时相似的 结构和形态，防止离体组织自溶 和细菌繁殖导致的组织腐败。2、保持定位细胞内特殊的成分，如 细胞内的一些蛋白质经过固定， 可沉淀或凝固定位在细胞的原有 部位。5、有利于保存抗原及DNA、RNA， 为免疫组化染色和核酸原位杂交 做准备。三、组织固定的注意事项 1、取材后要及时固定，尤其是温度高 的季节，以免腐败。 2、容器：最好选择广口的容器，一是 避免组织受挤压变形，二是方便取 材时易于取出。 3、固定液要足量，至少应为组织块总 体的5倍以上。5、固定时间：视组织块大小、固定温 度、固定液种类而定。一般固定3 小时以上，然后保存于70%酒精中。 温度低于40C时，固定时间应延长

4、（但不能太长） 。大标本除延长固 定时间外，还应做多个切面固定， 以免固定不均匀。四、固定方法 1、浸泡法。 2、蒸汽固定法：常用于固定组织中 的可溶性物质。 3、注射灌注固定法：用于组织块过 大或固定剂难以进入其内部的标 本（如整个器官、整只动物）。 4、滴加法：细胞涂片。 5、微波固定法（63650C）：具有 核膜清晰、染色质均匀、组织结 构收缩小等优点，但由于其固定 时间不易掌握，多不主张运用于 小组织块固定。 五、常用固定液及其配制（一）单纯固定液：由单一化学物质 组成。 1、甲醛 （1）优点：价格便宜、组织穿透力强、 固定均匀、组织收缩小，可长期 保存标本。 （2）缺点：易挥发，有一

5、定毒性。 （2）性质：交联性组织固定剂，主要 通过使蛋白质分子发生交联而产 生固定作用。它虽不能使白蛋白 和核蛋白沉淀，但能与蛋白质中 许多氨基酸反应。（3）适用范围：适合多种特殊染色， 对脂类和类脂体、神经及髓鞘 均有良好的固定效果；也可固 定高尔基体、线粒体和糖类。（4）使用浓度：10%，即10ml市售 原液（40%）加90ml的水，此 液的甲醛实际浓度为4%。 3、酒精（1）优点：具有硬化、固定、脱水等 作用，还能保存糖原和尿酸结晶。（2）使用浓度：固定组织用80% 95%为好，70%的酒精可用于保 存组织。（3）缺点：组织渗透力较弱；能沉淀 白蛋白、球蛋白和核蛋白，核蛋 白沉淀后能溶于

6、水，使核染色不 良；高浓度酒精固定的组织硬化 显著，组织收缩明显且脆，既影 响切片，又致组织形态改变，影 响诊断；溶解脂肪、类脂质和血 红蛋白，还损害其它色素，有时 也可影响诊断，故多不使用。 2、Bouin液（1）优点：渗透力强，对组织固定 均匀，收缩很小，不会使组织 变硬变脆，适用于睾丸活检等 小组织的固定。（2）固定时间：小块组织只需数小 时，较大脏器固定1224小时。（3）配制方法： A、苦味酸饱和水溶液75ml，40%甲 醛水溶液25ml，冰醋酸5ml。 B、80%酒精150ml， 40%甲醛水溶 液60ml，冰醋酸15ml，结晶苦味 酸1g，用前配制。 3、Zenker液（1）优点

7、：此液固定的标本，胞核 和胞质染色清晰。（2）固定时间：1224小时。（3）配制方法：重铬酸钾2.5g，升汞 5.0g，蒸馏水100ml。将升汞、 重铬酸钾和蒸馏水混于烧杯中， 加热（40500C）溶解，冷却后 过滤，贮存与棕色瓶中。临用时 取贮存液95ml，加入冰醋酸5ml， 即为Zenker液。（4）缺点：配制该液的试剂较昂贵， 且需处理汞。 4、Carnoy液（1）优点：穿透力强，能很好地固定 胞质和染色质，特别适合固定外 膜致密的组织。在固定组织的同 时，能溶解大部分脂肪。也使用 于糖原及尼氏小体的固定，对显 示DNA和RNA的效果很好。（2）固定时间：小块组织固定12小 时。（3）配

8、制方法：无水酒精60ml，冰醋 酸10ml，氯仿30ml。（4）缺点：氯仿有毒。第三节 组织的脱水、透明 浸蜡和包埋一、脱水 指用某些溶媒置换组织内水分的过程。脱水剂必须能与水任意比例混合。常用的脱水剂有酒精、丙酮及叔丁醇，但丙酮组织收缩作用强而较少应用。 二、透明 组织块中的水分被溶剂所取代，组织块变得透亮，此过程称为透明。最常用的透明剂为二甲苯，因其既能与酒精混合，又能溶解石蜡。处理时间一般为30min左右。其它透明剂还有苯、甲苯、氯仿、环己酮、苯甲酸甲酯、香柏油、冬青油和苯胺油等。三、浸蜡 组织透明后在溶化的石蜡内浸渍的过程称之。用其它浸透剂渗入组织内部的过程称为渗透或透入。常需经过3小

9、时的浸渍，期间需更换3次石蜡。用于浸蜡的石蜡熔点为52560C。四、包埋 组织块经过浸蜡或浸透，再用包埋剂包起的过程称包埋。包埋后的组织块具有一定的硬度和韧度，有利于切薄片。常用的包埋剂有石蜡、火棉胶、碳蜡、明胶和塑料等，可根据不同的研究需要选用。第四节 切片一、石蜡切片 1、厚度：35m。 2、附贴（400C的恒温热水中完 全展开）。 3、烤片：56600C，经3060min. 4、染色： 5、封片： 6、编号：7、用于DNA提取的石蜡切片一般为 5 10m，用小镊子夹入微量 离心管中，每管可装5 10片。8、切片过程中应严格注意防止标本 间的交叉污染，以避免假阳性。9、应避免刀痕、皱折和残

10、缺。二、冷冻切片 1、适用范围：快速病理诊断、酶组化 染色、苏丹染色等。 2、厚度：68m。 3、优点：能较完整地保存酶类及各种 抗原活性，尤其是细胞表面抗原。 4、缺点：冷冻过程中组织细胞内容易 形成“冰晶”，影响细胞形态及抗原 定位，严重是甚至损伤细胞结构。 5、克服缺点的方法速冻法（1）液氮法：将所取组织块平放于平盖 或标本盒等适当容器内，缓慢放入 盛有液氮的小杯内。当组织块接触 液氮开始汽化沸腾后，使组织块保 持原位，组织即由底部向表面迅速 冷冻形成冻块，取出后用铝箔包 好，编号存入液氮罐或-700C低温 冰箱内，可保存数月 至数年。（2）干冰-丙酮法：将组织块放进内盛 OCT包埋剂或

11、甲基纤维素糊状液 的容器内，组织块完全浸没即可。 将丙酮倒入盛有10g干冰的保温杯 调成糊状，将装有组织块的标本盒 放入保温杯，待包埋剂成白色冻块 时，如（1）法保存。 6、组织速冻时应注意（1）标本盒不能直接进入液氮，以免组 织膨胀破裂；（2）速冻的包埋剂应适量；（3）新鲜组织不能放入-100C冰箱内缓 慢冷却，否则组织内水分可逐渐析 出形成冰晶，造成组织结构破坏。第五节 常用的病理染色 技术及其应用一、苏木素-伊红染色 能较好地显示组织结构和细胞形态保存时间长；应用广泛，被称为常规染色。 1、染色步骤（略）2、结果显示：细胞核呈蓝色；细胞 质、肌肉、结缔组织、红细胞和 嗜伊红颗粒呈不同程度

12、的红色。 钙盐和各种微生物也可染成蓝色 或紫蓝色。 3、注意事项（1）切片脱蜡应彻底；（2）根据染片多少和染液新鲜程度掌 握染色时间长短；（3）分化处理要适度；（4）染色后酒精脱水应遵循从低浓度 到高浓度，由快到慢，次第脱水， 使切片色泽鲜艳，明亮清晰。二、常用特殊染色方法及其应用 1、结缔组织染色 结缔组织含有三种纤维，即胶原纤维、网状纤维和弹力纤维。它们在H.E染色时不易区分，特染可鉴别。（1）胶原纤维染色 1）目的：判断梭形细胞肿瘤的来 源；鉴定心肌瓣痕灶、早期肝 硬化以及其它纤维组织增加或 减少性病变等； 2）常用方法：Masson三色染色法； 3）结果：胶原纤维呈蓝色，肌纤维 和红细

13、胞呈红色，细胞核为蓝褐 色； 4）注意事项： Masson复合染色液 经磷钨酸分化时须在显微镜下控 制至肌纤维清晰为止；苯胺蓝可 用亮绿染料替换，此时胶原纤维 染成绿色。（2）网状纤维 1）目的：显示网状纤维和基底膜。 用于鉴别上皮性与非上皮性 肿瘤；某些间叶组织肿瘤； 判断原位癌与早期浸润癌。 观察肝组织的网状支架塌陷、 破坏或增生等改变。2）常用方法：Gomori银染色法；3）结果：网状纤维呈黑色，胶原纤维 呈红色，背景呈黄色；4）注意事项：配制氨性银溶液必须 将器皿洗干净，所用蒸馏水要纯； 加氨水要适量，宜现用现配，以 免银盐析出，影响染色结果；氧 化液存放时间不能长，以免失去氧 化作用

14、；丽春红复染液一般须滴 染，无水乙醇冲洗时要将切片倾斜， 以防染液停留在切片上而造成的组 织中胶原纤维分布不均的假象。（3）弹力纤维染色 1）目的：观察皮肤组织的增殖变化、 老年性肺气肿的纤维断裂、变性 或萎缩、高血压病时小动脉管壁 弹力纤维的异常增生、AS动脉管 壁弹力纤维的崩解、断裂与缺失、 实验动物组织中的血管壁损害和 增生情况。2）常用方法：醛品红弹力纤维染色法；3）结果：弹性纤维呈深紫色，底色为 不同程度的黄色；4）注意事项：醛品红染液要置冰箱 内保存，用时恢复至时温；橙黄 G液要淡染，否则会掩盖弹力纤维 的深紫色。 2、糖类染色（1）糖原染色 1）目的：明确细胞内空泡性质；糖 原贮

15、积病的诊断；某些透明细胞肿 瘤的鉴别诊断；低分化腺癌的诊断； 早期浸润癌的判断；肾小球肾炎 的分类诊断；显示腺泡状软组织肉 瘤瘤细胞胞浆内结晶物、浆细胞胞浆 内的Russll小体和核内的Dutcher小 体及真菌与寄生虫卵等。2）常用方法：PAS法；3）结果：糖原及其它PAS阳性反应物 质呈红色，细胞核呈蓝色；4）注意事项：组织固定要及时，取 材要小，以免糖原颗粒居于细胞一 端；配制Schiff液的重亚硫酸钠 质量必须纯；Schiff液应置冰箱 内保存，用时取出恢复室温后再进 行染色；应设对照片（用唾液或 1%淀粉酶消化后染色）；染色时 间示温度而定，夏季短，冬季长。（2）粘液物质染色 1）目的：粘液性上皮肿瘤的鉴别； 证明肿瘤内是否有粘液； 2）常用方法：Alcian blue-PAS 法； 3）结果：中性粘液物质呈红色，酸 性粘液物质呈蓝色；4）注意事项： Alcian blue染色时， 玻片上不能涂白胶或火棉胶，以免 背景着色；染PAS时采取滴染法， 用过的试剂不能再用。 3、组织中脂类的显示（1）目的：鉴别细胞内空泡的性质，对某些肿瘤的诊断有意义；显示胆固醇沉积、脂肪栓塞、先天性类脂质沉积病；（2）常用方法：苏丹染色；（3）结果：中