免疫细胞的分离技术2011课件

1、 一、免疫细胞的种类与特征 二、免疫细胞的分离技术 三、免疫细胞分离的临床意义第三节免疫细胞的分离技术 免疫系统的组成免疫系统免疫器官中枢: 胸腺、骨髓周围：淋巴结、脾脏、粘膜 相关淋巴组织等免疫细胞：淋巴细胞、单核-巨噬细胞 、 粒细胞、DC、肥大细胞、 NK细胞免疫分子：抗体、补体、细胞因子、MHC、 TCR、粘附分子等 Innate immunity 固有免疫 定义：人类在种系进化过程中形成的、经遗传获得 的免疫，遇病原体后首先并迅速起防卫作 用的免疫应答组成：皮肤、粘膜及其产物、细胞（NK细胞、单 核-吞噬细胞、DC、NKT、中性粒细胞、T 细胞、B1细胞）等特点：先天具有、无潜伏期、

2、无特异性、无记忆性 作用时间：0-96小时 Adaptive immunity 获得性(适应性)免疫 定义：机体在生活过程中，因接触抗原性物质而获 得的免疫。T、B细胞识别病原体成分后产 生的免疫应答 特点：后天获得、有潜伏期、特异性，记忆性 参与细胞：T细胞和 B细胞 起作用时间：晚，一般在感染后4-5天发挥作用一、免疫细胞的种类与特征 免疫细胞的起源与分化抗原提呈细胞（antigen presenting cell, APC）加工处理抗原，将抗原肽提呈给抗原特异性淋巴细胞的一组免疫细胞。血液中主要的APC细胞主要包括单核细胞、树突状细胞、B细胞其他细胞自然杀伤(NK)细胞，肥大细胞，嗜酸性

3、粒细胞，嗜中性粒细胞，嗜碱性粒细胞，血小板等NK细胞肥大细胞嗜酸性粒细胞嗜中性粒细胞嗜碱性粒细胞血小板免疫细胞的特征1、免疫细胞的形态学特征 理化性状 生物学特性人CD分组分 组 CD（举例）T细胞 CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD28、CD152(CTLA4)、 CD154(CD40L)、CD272(BTLA)、CD278(ICOS)、CD294(CRTH2)B细胞 CD19、CD20、CD21、 CD40、CD79a(Ig)、CD79b (Ig)、 CD80 (B7-1)、CD86 (B7-2) 、CD267(TACI)、CD268(BAFFR)、 CD269(BCMA)、CD

4、307(IRTA2)髓样细胞 CD14、CD35(CR1)、CD64 (FcRI)、CD256(APRIL)、 CD257(BAFF)、CD312(EMR2) 血小板 CD36、CD41(整合蛋白IIb)、CD42aCD42d、CD51(整合蛋白v) 、 CD61 (整合蛋白3) 、CD62P(P选凝素)NK细胞 CD16 (FcRIII) 、CD56(NCAM-1)、CD94、CD158(KIR)、 CD161(NKR-P1A)、CD314(NKG2D)、CD335(NKp46)、 CD336(NKp44)、CD337(NKp30) 非谱系 CD30、CD32(FcRII)、CD45RA、C

5、D45RO、CD46(MCP)、 CD55(DAF)、CD59、CD252(OX40L)、 CD279(PD1)、 CD281CD284(TLR1-TLR4)、CD289(TLR9)、 CD305(LAIR-1)、 CD306(LAIR-2)、CD319(CRACC) 人CD分组分 组 CD（举例）黏附分子 CD11a-CD11c、CD15、CD15s(sLx)、CD18 (整合蛋白2) 、 CD29 (整合蛋白1)、CD49aCD49f、CD54(ICAM-1)、 CD62E(E整合蛋白)、CD62L (L整合蛋白)、CD324(E-cadherin)、 CD325(N-cadherin)、

6、CD326(EpCAM)细胞因子/ CD25(IL-2R)、CD95(Fas)、CD116-CDw137、CD178(FasL)、 趋化因子受体 CD183(CXCR3)、CD184(CXCR4)、CD195(CCR5)、 CD261CD264(TRAIL-R1TRAIL-R4)内皮细胞 CD105(TGF-RIII)、CD106(VCAM-1)、CD140(PDGFR)、 CD144(VE钙黏蛋白)、CD299(DCSIGN-related)、 CD309(VEGFR2)、JAM1(CD321)、JAM2(CD322) 碳水化合物结构 CD15u、CD60aCD60c、CD75、CDw327

7、CDw329(siglec6、7、9)树突状细胞 CD85(ILT/LIR)、CD273(B7DC)、CD274CD276(B7H1-B7H3) 、 CD302(DCL1)、CD303(BDCA2)、CD304(BDCA4)干细胞/祖细胞 CD133、CD243 基质细胞 CD292(BMPR1A)、CD293(BMPR1B)、 CD331CD334(FGFR1FGFR4)、CD339(Jagged-1)红细胞 CD233CD242 免疫细胞分离基本原理 不同细胞密度不同 不同细胞表面生物学特性不同 不同细胞表面分化抗原不同根据不同的实验目的可以采取下列不同的分离方法免疫细胞的分离技术1、密度

8、梯度离心法2、黏附分离法（尼龙毛法、贴壁法、亲和板法）3、磁性分离法4、荧光激活分离法5、其他分离法（花环沉降法）（一）外周血单个核细胞分离 外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMC）包括淋巴细胞和单核细 胞 Ficoll分离液法主要用于分离外周血中的单个核细 胞，是根据不同细胞密度不同的分离法不同细胞密度不同 单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度 为1.077左右 人的红细胞密度为1.093，1.077 粒细胞密度为1.092， 1.077 血小板密度 1.077 肝素抗凝静脉血与等量Hanks液或PBS混匀沿管壁缓慢叠加于Fico

9、ll分层液面上水平离心2000 rpm 20 min离心后管内分三层，用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞洗涤细胞两次RPMI1640重悬细胞台盼兰染液混合计数细胞活力检测：死的细胞可被染成兰色，活细胞不着色活细胞数活细胞百分率100总细胞数 方法用本法分离PBMC，一般纯度在90以上，收获率可达8090，活细胞百分率在95以上（二）T淋巴细胞及其亚群的分离T淋巴细胞亚群T细胞的发育阶段分类 初始T细胞 naive T cells 未经抗原刺激的成熟T细胞，表达CD45RA效应T细胞 effector T cells 表达高亲和力IL-2R，介导免疫效应记忆T细胞 memory T cells

10、 表达CD45RO，介导再次免疫应答T淋巴细胞亚群表达TCR的类型分类 TCR+ T细胞 TCR+ T细胞 T淋巴细胞亚群T细胞功能分类 辅助性T细胞 Helper T cells , Th 效应T细胞 Effector T cells , TE细胞毒T细胞 Cytotoxic T lymphocytes, CTL迟发性变态反应T细胞Delayed T cells，Td初始T细胞Naive T cells 调节性T细胞Regulatory T cells，Tr记忆T细胞Memory T cells，Tm抑制性T细胞Suppressor T cells，Ts 辅助性T细胞 Helper T ce

11、lls , Th Th1: 细胞免疫 Th2：体液免疫Th17：炎症反应辅助性T细胞 Helper T cells , ThTGF-+IL-6辅助性T细胞 Helper T cells , Th滤泡辅助性T细胞（Tfollicularhelper，Tfh）通过细胞因子IL-10和IL-21来调节B细胞的功能 CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的分化Foxp+T调节细胞可以从胸腺直接分化，也可在TGF-作用下从Foxp3-T细胞分化。调节性T细胞Regulatory T cells，Tr玫瑰花结法（E花环沉降法） 尼龙毛柱分离法 淘洗法免疫磁珠法流式细胞术分选法（二）T淋巴细胞及其亚群的

12、分离人T淋巴细胞表面表达CD2分子，即绵羊红细胞受体， B细胞则无。在适当的条件下，可与绵羊红细胞（SRBC）结合，形成玫瑰花结（rosette）,因为红细胞环绕T细胞，形似花环，所以又称E-花环（E-rosette）该实验常用于临床检测人外周血T淋巴细胞的数量和比例，由此可间接反映机体的细胞免疫功能状况 玫瑰花结法淋巴细胞 + SRBC悬液 37C水浴 10 min 低温低速离心 T细胞形成E花环而沉于管底 悬液中为B细胞。 方法 混合单个核细胞悬液在通过尼龙毛柱时，B细胞、浆细胞、单核细胞和一些辅助细胞被选择性粘附于尼龙毛上，而T细胞不与尼龙毛粘附的特性，这是获得富含T细胞群的有效方法尼龙

13、毛柱分离法简单，快速，经济，尼龙毛可反复利用可分离大量细胞细胞不会被激活，可用于功能测定纯度不高耗时优点 缺点 也叫亲合板结合分离法 (immune panning isolation）。利用亲合层析和抗体固相包被原理，将相应抗体结合于塑料平板上，由于各种淋巴细胞亚群具有不同抗原性的特点和表面标志，加细胞悬液后，凡抗原阳性的细胞则与相应的固相抗体结合，抗原阴性的细胞可从未吸附的细胞悬液中获取同理若用特异性抗原交联于塑料板上，则可分离得到具有特异抗原受体的淋巴细胞。但淋巴细胞受体与特异抗原或抗体连接后有可能引起细胞激活，因此，凡欲去除细胞悬液内某一细胞亚群时，本法更合适 淘洗法亲和板分离淋巴细胞

14、示意图利用T淋巴细胞表面某种标志性抗原与包被在固相载体上的特异性单抗结合，将T细胞与其他细胞分离的方法T淋巴细胞淘洗分离原理羊抗兔Ig包被平皿CD4 一抗培育T细胞，倒入平皿，4孵育1小时；收集未粘附的CD4-T细胞PBS漂洗非特异吸附的CD4-T细胞收集粘附的CD4+T细胞，可以用刮板刮取并在显微镜下观察 方法 （以CD4+T细胞为例）免疫磁珠法分离细胞是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使细胞得以分离 免疫磁珠法（Magneti

15、c activated cell sorting, MACS）NS阳性选择法（正选）NS阴性选择法（负选） 免疫磁珠细胞分选装置将特异性抗T细胞表面分子的单克隆抗体与磁性小珠形成免疫磁珠，用这种免疫磁珠从PBMC中结合T细胞在磁场中，结合T细胞的免疫磁珠固定了，未结合的其它细胞被洗脱下来撤离磁场，再从免疫磁珠上洗脱 T细胞 免疫磁珠法 阳性选择T细胞 将多种特异性抗非T细胞表面分子的单克隆抗体与磁性小珠形成免疫磁珠，用这种免疫磁珠从PBMC中结合非T细胞在磁场中，结合其它细胞的免疫磁珠固定了，未结合的T细胞被洗脱下来免疫磁珠法 阴性选择T细胞 CD4+ T Cell Isolation Kit

16、 II Non-CD4+ T cells in PBMC, i.e., CD8+ T cells, / T cells, B cells, NK cells, dendritic cells, monocytes, granulocytes, and erythroid cells, are indirectly magnetically labeled by using a cocktail of biotin-conjugated antibodies against CD8, TCR /, CD19, CD56, CD14, CD16, CD36, CD123, and CD235a (

17、glycophorin A). These cells are subsequently magnetically labeled with Anti-Biotin MicroBeads for depletion. Thereby, highly pure CD4+ T cells are obtained. 免疫磁珠法 阴性选择CD4+ T细胞实例 PBMC before separation Untouched CD4+ T cells荧光激活细胞分离法(fluorescence activated cell sorter, FACS)FACS用途：用流式细胞仪对单个细胞进行快速定量分析

18、与分选的一门技术原理：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99% 方法 （以CD4+ T细胞为例）PBMC用PBS洗涤，低温离心弃上清；加入含AB血清的PBS封闭，4孵育10分钟；加入适量的PerCP-CD3，APC-CD4抗体，4孵育30分钟；PBS洗涤，低温离心弃上清并用RPMI 1640重悬；流式细胞术分选；（三）B淋巴细胞及其亚群的分离如果仅考虑PBMC中T细胞和B细胞，那么所有从PBMC中分离T淋巴细胞的

19、方法实际上也可用于分离B淋巴细胞。B细胞表面标志 SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体，部分CD分子是B细胞的重要表面标志，其中以SmIg为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标 CD19/CD5分子：可将B细胞区分为B1细胞和B2细胞，B1细胞为CD19和CD5双阳性，而B2细胞仅为CD19阳性，B2细胞为通常所指的B细胞 终浓度5 mM L-leucine methyl ester (L-LME)重悬PMBC，混匀，室温35s离心，400 g，10 min，弃上清，PBS洗涤细胞重悬于25 ml RPMI 1640培养基，过尼龙毛柱，去除细胞团块玫瑰花结法去除T细胞抗CD19或CD20

20、单抗标记，流式细胞仪检验B细胞纯度去除Mo/M法将特异性抗B细胞表面分子CD19的单克隆抗体免疫磁珠与PBMC混合，用这种免疫磁珠从PBMC中结合B细胞在磁场中，结合B细胞的免疫磁珠固定了，未结合的其它细胞被洗脱下来撤离磁场，再从免疫磁珠上洗脱 CD19+B细胞 免疫磁珠法 阳性选择B细胞 将多种特异性抗非B细胞表面分子的单克隆抗体与磁性小珠形成免疫磁珠，用这种免疫磁珠从PBMC中结合非B细胞在磁场中，结合其它细胞的免疫磁珠固定了，未结合的B细胞被洗脱下来免疫磁珠法 阴性选择B细胞 B Cell Isolation Kit II Non-B cells, i.e., T cells, NK c

21、ells, monocytes, dendritic cells, granulocytes, platelets, and erythroid cells, are indirectly magnetically labeled using a cocktail of biotinylated CD2, CD16, CD14, CD36, CD43, and CD235a (glycophorin A) antibodies. These cells are subsequently magnetically labeled with Anti-Biotin MicroBeads for d

22、epletion. Highly pure B cells are obtained by depletion of magnetically labeled non-B cells.PBMC before separation Untouched B cells免疫磁珠法 阴性选择B细胞实例 （四） Mo/M分离技术 单核-巨噬细胞包括骨髓中的前单核细胞、外周血中的单核细胞、以及组织内的巨噬细胞(M)。M来源于血液中的单核细胞，而单核细胞又来源于骨髓中的前体细胞。Mo/M细胞表面标志 表面标志抗原：CD14，但CD14也表达在粒细胞。 CD14主要强表达在单核-巨噬细胞，弱表达在粒细胞上 无

23、血清RPMI 1640培养液将PBMC 2106 cell/ml重悬；75 ml培养瓶中加入10 ml细胞悬液，于培养箱内37孵育1小时；吸尽培养液，RPMI 1640培养液漂洗2遍，去除非黏附细胞；细胞刮片轻轻刮取黏附的单核细胞。黏附法快速，方便纯度和得率均较低易引起Mo/M激活，引起基因表达和分泌蛋白优点 缺点 将特异性抗单核细胞表面分子CD14的单克隆抗体免疫磁珠与PBMC混合，用这种免疫磁珠从PBMC中结合单核细胞在磁场中，结合单核细胞的免疫磁珠固定了，未结合的其它细胞被洗脱下来撤离磁场，再从免疫磁珠上洗脱 CD14+单核细胞 免疫磁珠法 阳性选择单核细胞 将多种特异性抗非单核细胞表面

24、分子的单克隆抗体与磁性小珠形成免疫磁珠，用这种免疫磁珠从PBMC中结合非单核细胞在磁场中，结合其它细胞的免疫磁珠固定了，未结合的单核细胞被洗脱下来免疫磁珠法 阴性选择单核细胞 Monocyte Isolation Kit II Non-monocytes, such as T cells, NK cells, B cells, dendritic cells, and basophils, are indirectly magnetically labeled using a cocktail of biotin-conjugated antibodies against CD3, CD7,

25、CD56, CD19, CD16, CD123, and CD235a (Glycophorin A), as well as Anti-Biotin MicroBeads. Highly pure unlabeled monocytes are obtained by depletion of the magnetically labeled cells.PBMC before separation Untouched Monocytes免疫磁珠法 阴性选择单核细胞PBMC用PBS洗涤，低温离心弃上清加入含AB血清的PBS封闭，4孵育10分钟加入适量的FITC-CD14抗体，4孵育30分钟PBS洗涤，低温离心弃上清并用RPMI 1640