第六章兽药残留检测技术苯并咪唑类课件

1、第六章 兽药残留检测技术第七节 苯并咪唑类药物残留的危害分析与检测方法 第六章 兽药残留检测技术第七节 苯并咪唑类药物残留的危害一、概述苯并咪唑类(Benzimidazoles，BEN)是一种驱虫剂,被广泛应用于动物寄生虫的治疗,同时还作为杀霉菌剂应用于庄稼存贮和运输期间,使其免受霉菌污染。自20世纪60年代早期,美国合成噻苯达唑以来,已合成数百种苯并咪唑类驱虫药。噻苯达唑作为第一个商品化的苯并咪唑类药物,曾广泛用于世界各地,用以驱除各种动物(如牛、绵羊、山羊、猪、马、禽等)胃肠道寄生虫。用于治疗时可一次内服给药,也可以低浓度置于饲料中长期使用做预防用。一、概述苯并咪唑类(Benzimidaz

2、oles，BEN)是由于噻苯达唑驱虫作用不强,用药剂量较大,且驱虫谱不广,目前,已逐渐为其他苯并咪唑类药物阿苯达唑、奥芬达唑、芬苯达唑、甲苯达唑、氟苯达唑等所取代。本类药物的特点是驱虫谱广,驱虫效果好,毒性低,甚至还有一定的杀灭幼虫和虫卵作用。苯并咪唑类中的帕苯达唑、坎苯达唑、阿苯达唑和奥芬达唑对妊娠早期(约妊娠三周)绵羊的胎儿有致畸作用,因此用于孕畜时应特别慎重。由于噻苯达唑驱虫作用不强,用药剂量较大,且驱虫谱不广,目前,苯并咪唑类药物的结构式苯并咪唑类药物是一个庞大的化学家族,包括噻苯达唑的同系物、苯并咪唑氨基甲酸酯类,以及苯并咪唑环上的各种侧链取代物。苯并咪唑氨基甲酸酯类苯并咪唑环噻苯达

3、唑的同系物苯并咪唑类药物的结构式苯并咪唑类药物是一个庞大的化学家族,包苯并咪唑类药物1、噻苯达唑(Thiabendazole, TBZ)2、坎苯达唑(Cambendazole, CAM)3、苯硫脲酯(Thiophanate)4、非班太尔(Febantel, FEB)5、芬苯达唑(Fenbendazole, FBZ)6、奥芬达唑(OxfendazoIe, OFZ)7、阿苯达唑(Albendazole, ABZ)8、甲苯达唑(Mebendazole, MBZ)9、奥苯达唑(Oxibendazole, OXI)10、氟苯达唑(Flubendazole, FLU)11、三氯苯达唑(Triclabend

4、azole, TCB)苯并咪唑类药物1、噻苯达唑(Thiabendazole, T1、噻苯达唑(Thiabendazole,TBZ)别名噻菌灵、特克多、涕必灵、硫苯唑、噻苯咪唑、噻唑苯咪,为白色至奶黄色粉末,无臭,味微苦,微溶于水或乙醇,易溶于稀盐酸或稀碱液中,不溶于氯仿或苯中。广谱驱虫药,可能是抑制虫体的延胡索酸还原酶。对动物多种胃肠道线虫均有驱除效果,对成虫效果好,对未成熟虫体也有一定作用。内服吸收快,广泛分布于各组织中。猪、羊、牛给药后27h达血药峰浓度。在体内迅速代谢成5-羟噻苯达唑(5-OH-TBZ)1、噻苯达唑(Thiabendazole,TBZ)别名噻菌灵犊牛用药后,肾中药物浓度

5、最高,但肝的滞留期比肾长;噻苯达唑、5-羟噻苯达唑在肝和肾中的残留量分别为57g/kg、581g/kg和153g/kg、19g/kg；休药6天只有肝中有5-羟噻苯达唑残留量(63g/kg)；噻苯达唑在肌肉和脂肪中未被检出，但5-羟噻苯达唑在用药后1日内可检出,其残留量分别为肌肉54g/kg、脂肪64g/kg。奶牛用药后12h,噻苯达唑、5-羟噻苯达唑在奶中的残留量分别为5007g/kg和168g/kg，84h时分别为20g/kg和25g/kg。犊牛用药后,肾中药物浓度最高,但肝的滞留期比肾长;噻苯达唑、2、坎苯达唑(Cambendazole,CAM)别名噻苯达唑酯,为广谱驱虫药。对动物肠道寄生

6、虫和肺蠕虫有明显作用。制剂有混悬剂、糊剂或饲料粉的形式。内服后在体内迅速代谢,原药和代谢物主要经胆汁排泄,尿中占给药量的25%,其中原形的不足5%。牛内服后30日内,肝中可检出残留物,其中一部分为结合态。坎苯达唑有致畸性,因此休药期要求适当的延长。牛休药期21天,羊休药期28天。2、坎苯达唑(Cambendazole,CAM)别名噻苯达唑3、苯硫脲酯(Thiophanate)别名硫菌灵、硫苯尿酯,属苯并咪唑的前体药物,即在动物体内转变成苯并咪唑氨基甲酸甲酯而发挥驱虫作用。本品为微黄棕色结晶性粉末,在水、甲醇、乙酸乙酯和丙酮中微溶,在环己酮中易溶。动物制剂有混悬剂和丸剂两种,或用作饲料添加剂。广

7、谱驱虫药,对大多数动物的胃肠线虫成虫及幼虫均有良好效果。内服吸收快而完全,8h达血药峰浓度。用药后24h,几乎能从所有组织器官中(特别是肝、肾)测出药物。用药后72h内,大部分药量经粪和尿排出体外。3、苯硫脲酯(Thiophanate)别名硫菌灵、硫苯尿酯,畜禽用药后,残留量在肝和肾中较高,而其他可食组织中相对较低。绵羊一次内服100mg/kg后休药1日,肝、肾、肌肉和脂肪中的残留量分别为930g/kg、1060g/kg、670g/kg和2930g/kg;休药3日后均低于100g/kg。犊牛一次内服100mg/kg后休药7日,肝、肾和肌肉中的残留量均低于200g/kg。猪一次内服75mg/kg

8、后休药1日,肝、肾、肌肉和皮/脂肪中的平均残留量分别为5550g/kg、6600g/kg、2600g/kg和16200g/kg;休药3日分别为180g/kg、100g/kg、肾脂肪肌肉。牛内服后18h,肝中约占总残留量的90%,其中芬苯达唑30%5、芬苯达唑(Fenbendazole, FBZ)别名硫苯达唑、苯硫达唑，无臭无味，在二甲基亚砜中溶解，在甲醇中微溶,在水中不溶,在冰醋酸中溶解。为广谱、高效、低毒的新型苯并咪唑类驱虫药。它不仅对动物胃肠道线虫成虫、幼虫有高度驱虫活性,而且对网尾线虫、矛形双腔吸虫、片形吸虫和绦虫亦有较佳效果。芬苯达唑在国外,不仅用于各种动物,甚至还有野生动物的专用制剂

9、。由于芬苯达唑溶解度较低,因而给动物内服时吸收极少,如给绵羊、牛、猪内服因吸收少,经粪便排泄的原形药约占44%50%,而经尿排泄的不足1%。5、芬苯达唑(Fenbendazole, FBZ)别名硫苯达吸收后芬苯达唑在动物体内迅速代谢为芬苯达唑亚砜(FBZ-SO)即奥芬达唑(OFZ)、芬苯达唑砜(FBZ-SO2)、芬苯达唑-2-氨砜(FEB-NH2-SO2)和一些少量的其他代谢物。原药和代谢物主要经胆汁排泄。在绵羊体内的代谢产物,由胆汁分泌后可再经肝肠循环。猪用药5mg/kg后休药7天,肝中母药残留量为0.28mg/kg,其他无组织残留。吸收后芬苯达唑在动物体内迅速代谢为芬苯达唑亚砜(FBZ-S

10、O牛用药10mg/kg后休药2天,肝、肾、肌肉和脂肪中的母药残留量分别为8.4mg/kg、1.04mg/kg、0.47mg/kg和0.95mg/kg;休药7天,只在肝中能检测到残留量0.67mg/kg。奶牛内服10mg/kg后,1224h奶中芬苯达唑浓度达峰值,休药7天降至100g/kg;12h芬苯达唑亚砜浓度达峰值,然后迅速下降,96h时未检出;48h芬苯达唑砜浓度达峰值,96h时未检出。鳟鱼内服后,在体内部分代谢为奥芬达唑,并蓄积于鱼皮中。母药和奥芬达唑的消除期分别为96h和24h。芬苯达唑砜代谢物在鱼体内几乎没有。牛用药10mg/kg后休药2天,肝、肾、肌肉和脂肪中的母药残6、奥芬达唑(

11、OxfendazoIe,OFZ)别名磺唑氨酯,为白色或类白色粉末,有轻微的特殊气味,在甲醇、丙酮、氯仿、乙醚中微溶,在水中不溶。奥芬达唑为芬苯达唑的衍生物,属广谱、高效、低毒的新型抗蠕虫药,其驱虫谱大致与芬苯达唑相同,但驱虫活性更强。奥芬达唑与阿苯达唑同为苯并咪唑类中,属内服吸收量较多的驱虫药。但反刍兽吸收量明显低于单胃动物,而且舍饲反刍兽比放牧时吸收量多。牛用药后1018天,牛肝中残留量从55.5g/kg降低至10g/kg。羊用药后1024天,羊肝中残留量从476g/kg降低至12g/kg。奶牛内服2.5mg/kg后1天,奶中的残留量为最高(0.49mg/kg),休药8日则降低至0.005m

12、g/kg;在4872h内奶中主要代谢物为芬苯达唑砜。休药期为牛11天、羊21天,产奶期禁用。6、奥芬达唑(OxfendazoIe,OFZ)别名磺唑氨酯,7、阿苯达唑(Albendazole,ABZ)别名丙硫苯咪唑、丙硫苯咪唑,为白色或类白色粉末,无臭,无味,在丙酮或氯仿中微溶,在乙醇中凡乎不溶,在水中不溶,在冰醋酸中溶解。高效广谱驱虫药,系苯并咪唑类药物中驱虫谱较广、杀虫作用最强的一种,对各种线虫、绦虫均有高度活性,对虫卵发育也有显著抑制作用。因不溶于水,故在肠道内吸收缓慢。7、阿苯达唑(Albendazole,ABZ)别名丙硫苯咪唑原药在动物体内的主要代谢产物为阿苯达唑亚砜(ABZ-SO)、

13、阿苯达唑砜(ABZ-SO2)和阿苯达唑-2-氨砜(ABZ-NH2-SO2),前者为杀虫的活性成分。在体内分布量依次为肝、肾和肌肉占内服后血药达峰时间为24h,并且持续1524h。原药与亚砜代谢物在血中的浓度极低,半衰期为8.510.5h。24h内约85%的给药量经肾排出,13%随粪排出。原药在动物体内的主要代谢产物为阿苯达唑亚砜(ABZ-SO)、牛和羊残留消除研究表明,用药后数日内组织中的代谢物浓度变化很大,刚开始时主要为亚砜代谢物,接着是砜类和氨砜类代谢物。用药后在日内牛肝和牛肾中的残留物有95%为结合态,但羊组织中结合态代谢物很少。奶牛内服10mg/kg后,12h奶中亚砜代谢物残留量达峰值

14、,然后迅速下降,36h时未被检出;24h砜类代谢物残留量达峰值,但消除缓慢,需156h可排净;氨砜代谢物在奶中的量很低,36h达峰值,消除期180h。其他代谢物在服后24h达峰值,48h时低于方法的检测限,但消除期为156h。牛和羊残留消除研究表明,用药后数日内组织中的代谢物浓度变化很8、甲苯达唑(Mebendazole, MBZ)别名甲苯咪唑,为白色、类白色或微黄色结晶性粉末,在甲酸中易溶,在冰醋酸中略溶,在丙酮或氯仿中极微溶解,在水中不溶。为广谱驱虫药,不仅对动物多种胃肠线虫有高效,而且对某些绦虫亦有良效,并且是为数不多治疗旋毛虫的良药之一。甲苯达唑早在20世纪80年代已广泛用于世界各国的

15、医学和兽医临床。8、甲苯达唑(Mebendazole, MBZ)别名甲苯咪唑内服后胃肠道吸收差(5%10%),吸收后迅速分布于血浆、肝、肺等,血药达峰时间为24h,半衰期2.55.5h。在动物肝内很少代谢,代谢物为极性很强的羟基(MBZ-OH)和氨基代谢物(MBZ- NH2)。在2448h内经粪便排泄的原形药物约占80%左右,经尿排泄的约为5%10%。吸收后药物,仅有极少量以脱羧基衍生物形式排泄。内服后胃肠道吸收差(5%10%),吸收后迅速分布于血浆、肝二、组织中苯并咪唑残留和限量苯并咪唑类药物在动物体内的残留物与药物本身有关外,还与给药途径、靶组织和消除期有关。标志残留定义为母体药物及其主要

16、代谢产物的总和。阿苯达唑：ABZ用药后,在停药初期,残留物主要为ABZ-SO和ABZ-SO2;而在较长的停药期,主要残留物为ABZ-NH2-SO2,因此标志残留为ABZ-SO 、 ABZ-SO2和ABZ-NH2-SO2 的总和,以ABZ计。对FEB、FBZ和OFZ,标志残留为FBZ、OFZ(FBZ-SO)，和FBZ-SO2的总和,以FBZ-SO2计。药物消除研究表明,OFZ和FBZ-SO2是组织中最常见的残留物。二、组织中苯并咪唑残留和限量苯并咪唑类药物在动物体内的残留物在蛋中, 氟苯达唑FLU标志残留主要为母体药物,而在鸟类和猪可食组织中标志残留为FLU和FLU-HMET,因此以FLU和FL

17、U-HMET的总量来定义FLU的标志残留。甲苯达唑MBZ标志残留定义为MBZ、MBZ-OH和MBZ-NH2的总和,以MBZ计。残留消除研究表明,MBZ-NH2和MBZ-OH是组织中最持久的残留物,对最高残留限量(MRL)的影响最大。噻苯达唑TBZ标志残留定义为TBZ和5-OH-TBZ的总和。在动物可食组织中,TBZ的母体药物是最常见的残留物,但在牛奶中,5-OH-TBZ的硫酸酯结合物为主要残留。在蛋中, 氟苯达唑FLU标志残留主要为母体药物,而在鸟类和猪三氯苯达唑TCB标志残留定义为TCB、TCB-SO和TCB-SO2的总和。TCB禁止用于泌乳期动物,由于TCB-SO2消除时间长,因此它可以作

18、为残留监测的目标化合物。奥苯达唑OXI标志残留为母体药物。其他苯并咪唑类药物,如CAM、LUX、PAR和BEN,在欧盟禁止用于动物源食品,因此欧盟未规定MRL值。部分苯并咪唑类药物的标志残留和最高残留限量(MRL)。三氯苯达唑TCB标志残留定义为TCB、TCB-SO和TCB-部分苯并咪唑类药物的标志残留和最高残留限量(MRL)部分苯并咪唑类药物的标志残留和最高残留限量(MRL)三、样品处理苯并咪唑类分子含咪唑环结构,两个氮原子具有酸碱两性,在适当的pH条件下,分子可以质子化(pKa约56)或去质子化(pKa约12)。在酸性或碱性条件下,大部分苯并咪唑类药物可解离,易溶于水性溶剂,并被提取,然后

19、调节pH值使呈中性,用乙酸乙酯抽提。由于5-OH-TBZ在pH值范围内都能电离,易溶于酸性或碱性的水溶液,乙酸乙酯很难将其抽提出来。三、样品处理苯并咪唑类分子含咪唑环结构,两个氮原子具有酸碱两对于CAM、TCB和TCB代谢产物,它们都有两个或更多的pKa,因此溶剂提取时,控制溶液的pH值尤为重要。三氯苯达唑(TCB)、三氯苯达唑硫化物(TCB-SO)、 TCB-SO2和CAM分别在pH7.310.9、5.09.0、3.88.0和7.411.1呈中性,因此,只有当pH7.48.0时,所有这些分子都呈中性。大部分苯并咪唑类药物在pH8时都呈中性,当预测某些苯并咪唑类药物的pKa约为8时,这时欲对这

20、些组分同时提取变得相当困难。但也有例外,如MBZ-NO2和OXI在pH8.6和8.3,以非电离形式存在。对于CAM、TCB和TCB代谢产物,它们都有两个或更多的pK1、水解肝和奶样中苯并咪唑类药物与蛋白结合率较高,不易被有机溶剂提取,可先将样品水解后再提取游离的药物。常用的水解方法有酸水解和酶水解两种。酸水解通常使用无机酸,例如用4moL/L盐酸于80110 ,在14h即可完成水解。酸水解具有简便、快速、水解完全等优点,因而被广泛采用。1、水解肝和奶样中苯并咪唑类药物与蛋白结合率较高,不易被有机酶水解酶水解通常使用-葡糖苷酸酶或芳基硫酸酯酶,前者可专一地水解葡萄糖醛酸苷结合物,后者可水解硫酸酯

21、结合物。由于肝样中通常存在上述两种结合物,常使用-葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯混合酶,控制pH4.57.0,于一定温度下孵育1872h。与酸水解相比,酶水解比较温和,一般不会引起药物的分解,但有时水解不完全和实验费用高是该法的缺点。酶水解酶水解通常使用-葡糖苷酸酶或芳基硫酸酯酶,前者可专一Tocco等发现TBZ在尿和奶中的代谢产物主要是5-OH-TBZ与葡糖苷酸和硫酸酯结合物,结合物用-葡糖苷酸酶/硫酸酯酶或酸(6mol/L盐酸回馏1h)水解,释放出游离的5-OH-TBZ。Chuckwudebe等对TBZ在蛋鸡和奶牛中代谢产物进行了研究,发现结合物主要是硫酸酯结合物。Markus等对肝样中的ABZ及

22、其相关代谢物的结合物用酸解方法进行水解,释放出游离的ABZ-NH2-SO2。Coulet等对组织中的TBZ蛋白结合物用碱解方法水解。Tocco等发现TBZ在尿和奶中的代谢产物主要是5-OH-T2、提取及净化液-液萃取(LLP)是提取苯并咪唑类药物的最常用方法,通常将水性溶液调节至适当的pH值,用水不相溶的有机溶剂提取。用酸溶液提取时,即包括了样品的水解过程。由于苯并咪唑类药物的极性和pKa差异很大,因此多残留提取相当困难,即使对单一药物,母药及其代谢产物的同时提取亦难。2、提取及净化液-液萃取(LLP)是提取苯并咪唑类药物的最常例如MBZ及其两个代谢产物MBZ-OH和MBZ-NH2,由于MBZ和MBZ-NH2呈碱性,pKa分别是3.5和5.5,在pH7.5时,