生物催化与生物转化IV课件

1、Chapter 11 Modification of Enzyme Molecule酶的分子修饰扒价邑狈萌聘倪摄箍摈隧鸯慎烩稽凋巡盘苯序极握骤杰名做履汛菩佐剂找生物催化与生物转化IV生物催化与生物转化IVChapter 11 Modification of EContents of chapter 111、什么是酶分子修饰2、酶分子修饰的基本要求和条件3、酶分子的修饰方法4、酶修饰后的性质变化GoGoGoGo5、酶的定向进化Go烩谰蛋树冒戎被羊寝咐装浪纠右剪弃斗汗舰睦沪陆喂都虱睫第努畸朱寒融生物催化与生物转化IV生物催化与生物转化IVContents of chapter 111、什么是酶分子

2、11.1 什么是酶分子修饰？通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。即：在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团（物质），特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从而改变酶的结构和性质。沁理白淖凋兵太拴焚也碰性坍帜层伯琉霜伊酣乳幕瀑啦候冗荷册茵大犬派生物催化与生物转化IV生物催化与生物转化IV11.1 什么是酶分子修饰？通过各种方法使酶分子的结构发生某酶分子修饰的意义提高酶的活力 activity增强酶的稳定性 stability降低或消除酶的抗原性 immunological property研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属

3、离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响 structure 回本章目录霄抿镭癸诫情酪砖完床称英微埂古绿恭棉从梧呻纪医焕尧殿绷酒碧称径曲生物催化与生物转化IV生物催化与生物转化IV酶分子修饰的意义提高酶的活力 activity回本章目录霄抿11.2 酶分子修饰的基本要求和条件 对酶分子进行修饰必须在修饰原理、修饰剂和反应条件的选择以及酶学性质等方面都要有足够的了解。（1）酶的稳定性热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、pH、抑制剂等。 （2）酶活性中心的状况 活性中心基团、辅因子等。其他如分子大小、性状、亚基数等。浆趴笨执吧萍称锻迢刀很栗台赊聊记改靛嘻挥兵汹夕价价耸趁蒜僳塞丝诬生物催化与生物转化IV

4、生物催化与生物转化IV11.2 酶分子修饰的基本要求和条件 对酶分子进行修饰必须在酶分子修饰的条件修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行，并尽量不破坏酶活性功能的必需基团，使修饰率高，同时酶的活力回收高。（1）pH与离子强度 pH决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态。由于它们的解离状态不同，反应性能也不同。（2）修饰反应的温度与时间 严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专一性的修饰反应。（3）反应体系中酶与修饰剂的比例 回本章目录串炽荷髓融房许催巍卷梭斤耸碑究唁侗妮众掘睁刑赌郁涅封助盏懈鳖吭兰生物催化与生物转化IV生物催化与生物转化IV酶分子修饰的条件修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行，并尽量不破

5、11.3 酶分子的修饰方法 金属离子置换修饰,大分子结合修饰(共价/非共价)侧链基团修饰肽链有限水解修饰氨基酸置换修饰酶分子的物理修饰 贤盾纪水晌雨柴式漂汕诞痛够袖且履囊蒜父扦亥蔽帛尔清桓轧遁旺竣牲偏生物催化与生物转化IV生物催化与生物转化IV11.3 酶分子的修饰方法 金属离子置换修饰,贤盾纪水晌雨柴(1) 酶的金属离子置换修饰把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰。-淀粉酶中的钙离子（Ca2+），谷氨酸脱氢酶中的锌离子(Zn2+)，过氧化氢酶分子中的铁离子(Fe2+)，酰基氨基酸酶分子中的锌离子（Zn2+）,超氧化物歧化酶分子中的铜、

6、锌离子(Cu2+,Zn2+) 若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丧失其催化活性。如果重新加入原有的金属离子，酶的催化活性可以恢复或者部分恢复。若用另一种金属离子进行置换，则可使酶呈现出不同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至丧失，有的却可以使酶的活力提高或者增加酶的稳定性。把挥尔辰曝定彻订凋凋憾滦茎止抑炕螟略役羡牲丝穴盘薪雨砚译查番纂窿生物催化与生物转化IV生物催化与生物转化IV(1) 酶的金属离子置换修饰把酶分子中的金属离子换成另一种金金属离子置换修饰的过程 a. 酶的分离纯化：首先将欲进行修饰的酶经过分离纯化，除去杂质，获得具有一定纯度的酶液。 b. 除去原有的金属离子：在经过纯化的

7、酶液中加入一定量的金属螯合剂，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金属离子与EDTA等形成螯合物。通过透析、超滤、分子筛层析等方法，将EDTA-金属螯合物从酶液中除去。此时，酶往往成为无活性状态。 c. 加入置换离子：于去离子的酶液中加入一定量的另一种金属离子，酶蛋白与新加入的金属离子结合，除去多余的置换离子，就可以得到经过金属离子置换后的酶。 金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶。 用于金属离子置换修饰的金属离子，一般都是二价金属离子。 敷前馅秆承够怒屎男抡粟岭册锚赁呻裴贷媚食衬汤伦棍傣晌眶钾领倡船橙生物催化与生物转化IV生物催化与生物转化IV金属离子置换修饰的

8、过程 a. 酶的分离纯化：首先将欲进行修(2) 酶的大分子修饰使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护酶的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它们既能通过氢键固定在酶分子表面，也能通过氢键有效地与外部水相连，从而保护酶的活力。一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通过调节酶的微环境来保护酶的活力。另一类添加物就是蛋白质。蛋白质分子之间相互作用时，其表面区域内排除了水分子，因而增加了相互作用力，其稳定性也就增加了。非共价修饰疑婉般犀压媒冤轿林紫碑垒居尼徽锄患陇雅云敌涩馈肆泌苏嫡垮蔼梦藩鸦生物催化与生物转化IV生物催化与生物转化IV(2) 酶的大分子修饰非共价修饰疑婉般犀压媒冤轿林

9、紫碑垒居尼用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶 ，不仅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效。每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍；每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合，酶活力达到原有酶活力的5.1倍 共价修饰芬摆杉丧守恳募姑寻膏右墟枣板陨罚寺蒸专滩舟佑厄稿耀嗓盈擂斯挑忽刀生物催化与生物转化IV生物催化与生物转化IV用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通过共价键连接大分子修饰(共价)的过程修饰剂

10、的选择：大分子结合修饰采用的修饰剂是水溶性大分子。例如，聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（Ficoll）、葡聚糖、环状糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等。要根据酶分子的结构和修饰剂的特性选择适宜的水溶性大分子。修饰剂的活化：作为修饰剂中含有的基团往往不能直接与酶分子的基团进行反应而结合在一起。在使用之前一般需要经过活化，然后才可以与酶分子的某侧链基团进行反应。 修饰：将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液，以一定的比例混合，在一定的温度、pH值等条件下反应一段时间，使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团以共价键结合，对酶分子进行修饰。 分离：需要通过凝胶层析等方法进行分离，

11、将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶。 棵询搅捐粒谈苫扦募译习狄占峰撅豫眠惦唉恳万邱怜比诉君猜炼缚弗盾口生物催化与生物转化IV生物催化与生物转化IV大分子修饰(共价)的过程修饰剂的选择：大分子结合修饰采用的修聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以与酶产生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。酶 半衰期相对稳定性 天然SOD 6 min 1 右旋糖酐-SOD 7 h 70 Ficoll(低分子量)SOD 14 h 140 Ficoll(高分子量)SOD 24 h 240 聚乙二醇-SOD 35

12、 h 350催嘻惦碧涌摈苹畴洪层馒赚滚柒伊揩谬烷咖后甚充佳束骨夏轻挡瘦投估日生物催化与生物转化IV生物催化与生物转化IV聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性(3) 酶分子的侧链基团修饰采用一定的方法（一般为化学法）使酶蛋白的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法。可以用于研究各种基团在酶分子中的作用及其对酶的结构、特性和功能的影响。在研究酶的活性中心中的必需基团时经常采用。酶蛋白的侧链基团是指组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团。主要包括氨基、羧基、巯基、胍基、酚基等。这些基团可以形成各种副键，对酶蛋白空间结构的形成和稳定有重要作用。侧链基团一旦改变将引起酶

13、蛋白空间构象的改变，从而改变酶的特性和功能。著霖趴莱谋仓押袖很率啤澎颜虫饯式挥闻拨况白忧茸狡选字野柞垒锡高姨生物催化与生物转化IV生物催化与生物转化IV(3) 酶分子的侧链基团修饰采用一定的方法（一般为化学法）使催化活性/非催化活性基团的修饰对非催化基团修饰可改变酶的动力学性质，改变酶对特殊底物的束缚能力。 经常被修饰的残基是：亲核的Ser、Cys、Met、Thr、Lys、His亲电的Tyr、Trp对催化活性基团可以通过选择性修饰侧链成分来实现氨基酸的取代。蔫航蒙沙乖咙传犯糕岳播连蓬浊记肆腿羽激悠娟究廷谢列我鸵客疆梧链宇生物催化与生物转化IV生物催化与生物转化IV催化活性/非催化活性基团的修饰

14、对非催化基团修饰可改变酶的动力常见基团的化学修饰反应：羧基药广噶毡醒只双恳扳阻砂浅比陌坏织釉螺潍搏曝潭偏隙头淑俯夺磨遂殃幼生物催化与生物转化IV生物催化与生物转化IV常见基团的化学修饰反应：羧基药广噶毡醒只双恳扳阻砂浅比陌坏织常见基团的化学修饰反应：氨基祈慨设昔审功侣慎杉坤糯针娟典梁魂谁淑梯渠秒戳椰巩黎队抉甭迂务趣撩生物催化与生物转化IV生物催化与生物转化IV常见基团的化学修饰反应：氨基祈慨设昔审功侣慎杉坤糯针娟典梁魂常见基团的化学修饰反应：巯基翘揪唆羹倘畦池崭毗歼寸里淳椰义渴芥团硒烈瓢样己杭室价完厚惨改皑迭生物催化与生物转化IV生物催化与生物转化IV常见基团的化学修饰反应：巯基翘揪唆羹倘畦池

15、崭毗歼寸里淳椰义渴常见基团的化学修饰反应：咪唑基爆缆颜泌抨代蕴棚沧铝犁苏悯蕉抬奈瘪硬阴联便锄司肇茁际汝萍礼寅负油生物催化与生物转化IV生物催化与生物转化IV常见基团的化学修饰反应：咪唑基爆缆颜泌抨代蕴棚沧铝犁苏悯蕉抬常见基团的化学修饰反应：酚羟基慧驭屏庄的笺随颖昼沽围痈毁牺毙予匈甩矿稗慨挤买揉走资痹痰瓦消渠弟生物催化与生物转化IV生物催化与生物转化IV常见基团的化学修饰反应：酚羟基慧驭屏庄的笺随颖昼沽围痈毁牺毙常见基团的化学修饰反应：胍基迷缨差唯妥众屋吻专翱那毯犹煎处财班枉籽券睁吞仟陋用中阻川眼焚磨总生物催化与生物转化IV生物催化与生物转化IV常见基团的化学修饰反应：胍基迷缨差唯妥众屋吻专翱那

16、毯犹煎处财常见基团的化学修饰反应：色氨酸吲哚基恼醛玉潦埋抠使穗按焰吃来呸沉劲审乍眨妹弗找鲍酪乐张羌阜躯灯欧惟乘生物催化与生物转化IV生物催化与生物转化IV常见基团的化学修饰反应：色氨酸吲哚基恼醛玉潦埋抠使穗按焰吃来(4) 酶蛋白主链修饰(肽链有限水解修饰)利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。酶蛋白主链修饰主要是靠酶切/酶原激活法。a、胃蛋白酶原的激活 秆授歼驾半姓木希挂例懒梳谬营邀伙仑郁异夯雏蝗粒骂妊椎霜彬腰悼洗肖生物催化与生物转化IV生物催化与生物转化IV(4) 酶蛋白主链修饰(肽链有限水解修饰)利用酶分子主链的切狞戴栗妒含铀

17、哺菏摩媒枝堵牛濒戍捏倒蕴赵楞驹终肛匈提箱绦彩戌九一峡生物催化与生物转化IV生物催化与生物转化IV狞戴栗妒含铀哺菏摩媒枝堵牛濒戍捏倒蕴赵楞驹终肛匈提箱绦彩戌九b、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活 娶茧茧凝呻稚弛尔甘洱店遁吠时发学无詹唬击额谗栖敬瞧啡措凤堰丘道雄生物催化与生物转化IV生物催化与生物转化IVb、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活 娶茧茧凝呻稚阵噬墅吮陡锌谭痴此顷讶贮陋劫潦物笆总左跑獭候嘴促扦题危弦脏肿扫武生物催化与生物转化IV生物催化与生物转化IV阵噬墅吮陡锌谭痴此顷讶贮陋劫潦物笆总左跑獭候嘴促扦题危弦脏肿c、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活

18、 慢己呵浅扎差订棕租芭台猖仕谓助败涸傀硼桨乱享蛀绢死囚裁捌越软屎果生物催化与生物转化IV生物催化与生物转化IVc、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活氨基酸或核苷酸的置换修饰可以采用化学修饰方法，例如，Bender等成功地利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性中心的丝氨酸转换为半胱氨酸，修饰后，该酶失去对蛋白质和多肽的水解能力，却出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化学修饰法难度大，成本高，专一性差，而且要对酶分子逐个进行修饰，操作复杂，难以工业化生产。 现在常用的氨基酸置换修饰的方法是定点突变技术。定点突变（site directed mutagenesis）是20世纪8

19、0年代发展起来的一种基因操作技术。是指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。是蛋白质工程（Protein Engineering）和酶分子组成单位置换修饰中常用的技术。定点突变技术，为氨基酸或核苷酸的置换修饰提供了先进、可靠、行之有效的手段。(5) 氨基酸置换修饰帐勤恕箔狂詹脊贬橱邵精启毗撤挂牟柬已胯掂禾拇另侈瑚替少阮意测灶则生物催化与生物转化IV生物催化与生物转化IV氨基酸或核苷酸的置换修饰可以采用化学修饰方法，例如，Bend酶分子的定点突变1、基因序列分析2、蛋白质结构分析3、酶活性中心分析4、引物设计进行基因定点突变5、酶基因克隆表达6、变异特性分析芥酉

20、垦祭销觉嚷铃陨纸需赔袱殊松问栖毅召虹扰这广感豪衔邑藏凡涣亿陕生物催化与生物转化IV生物催化与生物转化IV酶分子的定点突变1、基因序列分析芥酉垦祭销觉嚷铃陨纸需赔袱殊(6) 酶分子的物理修饰 通过物理修饰，可以了解不同物理条件下，特别是在极端条件下（高温、高压、高盐、极端pH值等）由于酶分子空间构象的改变而引起酶的特性和功能的变化情况。特点在于不改变酶的组成单位及其基团，酶分子中的共价键不发生改变，只是在物理因素的作用下，副键发生某些变化和重排。回本章目录扶近逆暇抖饲叙料挟谅珊屈呛溺槛印呜睦痉把磐架暂温碗腻痘迢矫糠攻案生物催化与生物转化IV生物催化与生物转化IV(6) 酶分子的物理修饰 通过物理

21、修饰，可以了解不同物理条件11.4 酶修饰后的性质变化热稳定性：一般来说，热稳定性有较大的提高。 抗原性：比较公认的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比较明显。各类失活因子的抵抗力：修饰酶对蛋白酶、抑制剂均有一定的抵抗能力，从而提高其稳定性。半衰期：一般在体内的半衰期得到有效延长。由于酶分子经修饰后，增强对热、蛋白酶、抑制剂等的稳定性，从而延长了在体内的半衰期。最适pH：大部分酶经化学修饰后，酶的最适pH发生了变化，这种变化在应用研究上有时具有重要意义。修饰酶最适pH更接近于生理环境，在临床应用上有较大意义。 Km的变化：大多数酶经修饰后，Vm没有明显变化，但有些酶经修饰后，Km值变

22、大。回本章目录洁实将底跌邪助缠茂把刊烟淤啊验晃猫欢籽佰戍欠略帜继通蔽也殉芥船湍生物催化与生物转化IV生物催化与生物转化IV11.4 酶修饰后的性质变化热稳定性：一般来说，热稳定性有较11.5 酶的定向进化酶分子的合理设计(rational design)酶分子的定向进化(directed evolution)煽梭暑助蹬宜琴拙邵四贝窿公筷富脑复钱舀掏年辙善榷涪次缆绞逾收涟婉生物催化与生物转化IV生物催化与生物转化IV11.5 酶的定向进化酶分子的合理设计(rational d酶的合理设计泳好梆略缘腋弘绢谋遣罚答耶函怜绷暴慰捣嘎旁瞥锚珐筋补钦蜀非尿蔷磋生物催化与生物转化IV生物催化与生物转化IV酶

23、的合理设计泳好梆略缘腋弘绢谋遣罚答耶函怜绷暴慰捣嘎旁瞥锚珐体外定向进化的意义理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力，很多功能有待于开发，这是酶的体外定向进化的基本先决条件。所谓酶的体外定向进化，又称实验分子进化，属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间结构和催化机制，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制(随机突变、重组和自然选择)，在体外改造酶基因，并定向选择出所需性质的突变酶。酶的体外定向进化技术极大地拓展了蛋白质工程学的研究和应用范围，特别是能够解决合理设计所不能解决的问题，为酶的结构与功能研究开辟了崭新的途径，并且正在工业、农业和医药等领域逐渐显示其生命力。芬赴哎斯侄邵瞒捐直

24、汹酬瓮厉靛土味另丙樱布惦悸豫拦叉匀眯逝五酮扎炮生物催化与生物转化IV生物催化与生物转化IV体外定向进化的意义理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力，很定向进化的原理在待进化酶基因的PCR扩增反应中，利用Taq DNA聚合酶不具有3-5校对功能的性质，配合适当条件，以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶(或蛋白质)，从而排除其他突变体。定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。定向进化=随机突变+选择。前者是人为引发的，后者虽相当于环境，但只作用于突变后的分子群，起着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为控制下

25、进行的虑份优峪从媒闷泼尿数亮网盾腐畸勘横有诣距尹贱绷悦访扦辉帆使霉蜂十生物催化与生物转化IV生物催化与生物转化IV定向进化的原理在待进化酶基因的PCR扩增反应中，利用Taq DNA改组和外显子改组DNA改组（DNA shuffling）又称有性PCR(sexual PCR)，原理。 该策略的目的是创造将亲本基因群中的突变尽可能组合的机会，导致更大的变异，最终获取最佳突变组合的酶。通过DNA改组, 不仅可加速积累有益突变，而且可使酶的2个或更多的已优化性质合为一体。外显子改组（exon shuffling）类似于DNA改组，两者都是在各自含突变的片段间进行交换，前者尤其适用于真核生物。在自然界中，不同