脐血造血细胞体外集落培养最佳收获时机的探讨

1、脐血造血细胞体外集落培养最正确收获时机的讨论关键词：基质细胞;脐血;集落摘要:目的讨论脐血B多系造血集落培养在不同培养条件下脐血造血细胞体外扩增的最正确收获时机。方法将从新颖B标本中别离出的单个核细胞N分别接种于已建立的无血清培养基，该培养基分别含单用人骨髓基质细胞、单用细胞因子及细胞因子结合入骨髓基质细胞HBS支持培养体系。在0、6、10及14d各时间点分别取细胞进展巨细胞集落形成单位FU-K、红系爆式集落形成单位BFU-E及粒单细胞集落形成单位FU-G培养。结果在体外培养过程中，第10d时各组FU-K、BFU-E及FU-G数均高于组内其它时间点P0.05;在含HBS支持培养的组集落生成数优

2、于其它组P0.05。结论脐血N体外培养过程中，第10d可能是收获的最正确时机。FIBS能更好地维持造血干/祖细胞的活性，使其集落形成能数得到有效扩增。关键词:基质细胞;脐血;集落bservatinntheptiutiefrharvestingheatpietiellsfrrdbldafterultureinvitr.Abstrat:bjetiveTexplretheptialtiefrharvestingrdbldheatpietiellsulturedinvitrbylnyulti-pliatin.ethdsnnulearellsseparatedfrrdbldereulturedinase

3、ru-freesystesuppleentedithy-tkinesrhuanbnearrstralellsfbinatinfthe.FU-K，BFU-EandFU-Gereassessedbyseislidultureassaynd0，d6，d10andd14frdeterinatinfprgenitrunber.ResultsThequantityfFU-K，BFU-EandFU-Gnd10afterultureeresignifiantlyhigherthanthatftherulturetieP0.05.Thenuberflnyfringunitserehigherinthegrups

4、supprtedithhuanbnearrstralellsP0.05.nlusinTheptialtiefrharvestingthennulearellsisnthetenthdayafterinvitrulturefrdbldheatpietiells.Bnearrstralellsisapablefaintainingtheativityfheatpietiellsulturedinvitr.Keyrds:Stralell;rdbld;lny脐血中造血干/祖细胞含量少，难以满足大多数成人造血干细胞移植重建造血及免疫功能的需要，限制了其在临床上广泛应用。通过体外培养实现脐血造血细胞的有效

5、扩增便成为解决问题的关键。目前，脐血造血细胞体外扩增的培养体系多包含有不同的细胞因子组合和以骨髓基质细胞为滋养层以及以骨髓基质结合细胞因子等成分支持脐血体外扩增。在前期的研究中证实1，以上三种方式都可以使脐血造血细胞得到有效扩增，其中以第三种效果最好，但是造血细胞在体外培养过程中不可防止地产生过分化的现象，造成造血细胞体内移植才能的减弱。本实验通过观察扩增后造血干/祖细胞在不同时间点各系集落形成才能的变化，寻找脐血体外培养收获细胞的最正确时机。1材料和方法1.1人骨髓基质细胞层的建立无菌条件取出正常成人供者骨髓液约56l，经淋巴细胞别离液聚蔗糖一泛影葡胺，比重为1.077，购自中国医学科学院血

6、液研究所密度梯度离心制成单个核细胞N悬液，接种于含15%FBS，100kU/I青霉素，100g/L链霉素的ID培养体系中。细胞接种浓度为2106/l，2d后全量换液，以后每周半量换液2次，培养1014d，基质细胞层交融约80%后，经15Gy60照射备用。1.2脐血N液体培养体系无菌采集正常足月妊娠安康产妇的脐血10例，ADA抗凝，新颖脐血按4:1体积比参加羟乙基淀粉3045in去除沉淀的红细胞，经淋巴细胞别离液密度梯度离心别离山N悬液备用。无血清培养体系为StespanT培养液Steell公司产品。参加细胞因子SF、FL及TP浓度均为40ng/l英国Peprteh公司。脐血N接种浓度为1106

7、/l。实验分组如下:A、对照组:无细胞因子及HBS;B、培养液中含HBS:、培养液中仅含细胞因子:D、培养液中同时含细胞因子及HBS，种入252培养瓶于37，体积浓度为5%2的全湿培养箱中培养14d，分别在d6、d10及d14半量换液，计数细胞总数并取出细胞进展半固体集落培养。1.3脐血造血祖细胞集落培养对培养前脐血N及每次换液细胞进展FU-K、FU-G及BFU-E集落培养。BFU-E及FU-G用半固体ethultTGFH4434Steell公司培养基，含1%甲基纤维素，30%FBS，i%BSA，10-42-E，50ng/lrhSF，50ng/lG-SF，10ng/lrhlL-3，3U/lrh

8、EP，细胞接种于24孔培养板，培养14d后倒置显微镜下计数各种集落数，显微镜下以含50个细胞以上的细胞团为一个集落;FU-K用ethultT-试剂盒含无血清培养液、胶原及与D41结合的原位APAAP染色系统检测，详细操作方法根据试剂盒说明书进展。1.4统计分析运用SPSS11，0统计软件包分析，以P0.05为差异有显著性。2结果本实验所用半固体培养基ethultTGFH4434可支持FU-G及BFU-E等集落生长，接种第12d倒置显微镜下观察仍为分散的单个细胞，第3d开场增殖，起初为几个细胞丛，第7d后可见集落，714d集落不断增多，14d后集落逐步减少，集落形成单位为含50个以上细胞的细胞团

9、，其中FU-GU为无色的细胞团，有的呈密集型集落，有的呈疏散型;BFU-E为粉红色集落，集落内细胞完好，细胞间严密相连。FU-NK经固定及染色后为呈粉红色胞膜，淡蓝色核的细胞群体，而非巨核系集落或细胞簇那么仅核着色，呈淡蓝色。3个以上巨核细胞组成的细胞团称为FU-K。各组不同时间点集落形成单位体外扩增数，见表1。表1A组培养后各时间点各集落形成单位体外扩增数/105个N略注:各集落形成单位内d0与d6、d10及d14比拟时，P0.05;各集落形成单位内d6与d10及d14比拟时，P0.05;各集落形成单位内d10与d14比拟时，P0.05。表2B组培养后各时间点各集落形成单位体外扩增数/105

10、个N略注:各集落形成单位内d0与d6、d10及d14比拟时，P0.05;各集落形成单位内d6与d10及d14比拟时，P0.05;各集落形成单位内d10与d14比拟时，P0.05。表3组培养后各时间点各集落形成单位体外扩增数/105个N略注:各集落形成单位内d0与d6、d10及d14比拟时，P0.05;各集落形成单位内d10与d14比拟时，P0.05;各集落形成单位内d0与d10比拟时，P0.05，与d6及d14比拟时，P0.05;各集落形成单位内d6与d10比拟时，P0.05，与d14比拟，P0.05。表4D组培养后各时间点各集落形成单位体外扩增数/105个N略注:各集落形成单位内d0与d6、

11、d10及d14比拟时，P0.05;各集落形成单位内d6与d10及d14比拟时，P0.05;各集落形成单位内d10与d14比拟时，P0.05。A组对照组在体外培养过程中，随着时间的延长其各集落形成才能不断下降，到第14d时已无集落生长;B、及D组在体外培养的前10d中，其各系集落形成单位数不断增加，第10d后开场下降，第10d时各系集落单位数优于其它时间点P0.05。另外，统计分析说明，含HBS支持培养的B、D两组在培养后的各时间点其BFU-E、FU-G及FU-K数均较无HBS支持的组好P0.05。3讨论脐血体外扩增是解决脐血绝对数量缺乏的关键，目前研究指出，脐血造血细胞经扩增培养一段时间后，细

12、胞总数和造血祖细胞数量均显著增加，但另一方面，在培养过程中，造血干祖细胞会产生分化，造成造血细胞活性下降及植入才能降低。因此，改良并优化现有的培养体系是目前研究的热点之一。目前研究脐血造血细胞体外扩增的培养体系多包含有不同的细胞因子组合、以骨髓基质细胞为滋养层以及以骨髓基质结合细胞因子等成分。本实验采用以上三种培养体系对脐血造血细胞进展体外扩增，讨论其对各种集落形成单位的扩增才能及收获细胞的最正确时机。实验结果说明，在体外培养第10d时，BFU-E、FU-G及FU-K分别由原来的87.3073.3/105个N、121.0018.84/105个N、48.003.00/105个N增加到最高806.

13、90196.73/105个N、515.40189.11/105个N、457.5679.32/105个N，各组第10d时各集落形成单位数均优于其它时间点P0.05，第10d后集落形成才能减低，说明体外培养脐血造血祖细胞数在第10d到达最高值，体外培养最正确收获时机应在第10d左右，与国内莫文健2等的报道一致。本实验也说明，单用细胞因子组合支持脐血造血细胞体外培养，其扩增倍数不如用人骨髓基质细胞支持的好，这可能与单用细胞因子支持培养容易造成造血干祖细胞分化成熟有关，细胞因子组合结合人基质细胞支持脐血进展体外扩增，能局部抵消由细胞因子启动的长期培养启始细胞的分化，使造血祖细胞在得到大量扩增的同时能保持造血干细胞的活性3。参考文献:1angai-xia，aPing，LinXiu-Ei，etal.ExvivexpansinfrdbldnnulearellssupprtedbyhuanbnearrstralellsJ.hinJrganTransplant，2022，2610:616618.2en-jian，aPing，HeQiu-shan，etal.Exvivexpansinfegakaryyteprgenitrellsfrhuanrdbldinseru-freeul