高砷沉积物中砷形态转化的微生物作用机制

1、高沉积物中形态转化的微生物作用机制)要:采用实验室恒温培育的方式，利用分子生物等技术,在厌氧条件下,研究了 Fe(L)和碳源对雄黄矿区沉积 物中O的释放0结果显示雄黄矿区沉积物中O的释放主要是微生物的作用，并伴随铁的释放；在厌氧条件下添加电子 供体乙酸钠后，主要以As(L)的形式释放到水体中；厌氧环境下沉积物中O的释放是铁还原菌Geobacteraceae和O还 原菌共同作用的结果，其中微生物直接还原As( V)在控制O迁移转化的过程中比Fe(L)氧化物还原贡献更大,沉积物 中主要优势种群是由!变形菌门、Chlorof!ex)(绿弯菌门)和Firmicutes (厚壁菌门)所控制。关键词：O

2、;沉积物；迁移转化；地杆菌；o还原菌Microbial Mediation and Mechanism on the Speciation of Arsenicfrom Arsenic-enriched SedimentsAbstract: In this study, the effect of Fe(L) and carbon sources on the sediments bacterial community has been studied with molecular biology approaches by using anaerobic incubation theunde

3、r a constant temperature. The results showed that the biotic and abiotic processes may play a role in arsenic mobilization, but microorganisms remain defining in catalysing the redox transformations that ultimately control the mobility of the arsenic. Sediments incubated under anaerobic conditions s

4、howed Fe(L) reduction was concomitant with arsenic mobilization with time, principally as As( L). The sediments bacterial community structure changed and some key bacterial abundance significantly increased with the changes in environmental conditions. These results suggested that the directly reduc

5、tion of As ( V ) made greater contributions to arsenic release from sediments than reductive dissolution of arsenic-rich Fe (L) oxyhydroxides did. Alpha and gamma Proteobacteria and aci- dobacteria were found the dominant population in tailing sediment.Key words: arsenic; sediments; transformation a

6、nd mobilization; geobacteraceae; arsenate -reducing bacteriaN的生物地球化学调查表明自然环境中微生物在N的化学形态及循环方面起到至关重要的作 用1-2o过程控制N释放到地下水系统很复杂并且已经进行了广泛的研究，但仍然还存在强烈的争 论。已有几个微环境实验研究表明土著金属还原微生物(例如Geobacteraceae)在碑释放到地下含水层 中起到关键作用3-7。但有关这些土著微生物群落在碑迁移转化过程中的详细作用还没有特别描述。 而可溶的自然小分子有机酸是土壤中不稳定的碳源之一，其中，乙酸一旦释放到土壤溶液中可能被 土壤微生物利用，加速金

7、属矿物的风化。淹水能改变土壤氧化还原电位引起土壤短暂缺氧，吸附到 铁氧化物颗粒的碑很容易通过铁或N还原微生物的活动而溶解。因此，在环境条件改变下土著微生 物活动对沉积物中N移动的重要性值得深入研究。特别是对环境中不可培养的N代谢微生物的丰 度和群落结构进行进一步的研究，以确定其在碑迁移转化过程中的作用。1材料与方法1.1沉)物样品采集本试验供试沉积物采自湖南省石门县(黄矿废弃矿区附近。样品采集后密封保存于4 C冰箱 备用。1.2实验设计实验所用沉积物其有效态碑含量在34.15 mg-kg1，沉积物样品厌氧培育采用105 mL血清瓶预 先灭菌处理，然后添加(201) g沉积物，加入24 mL无菌

8、水或溶液&液面下氮吹30 min，液面上氮吹 30 min，然后盖上灰色丁基橡胶塞，用卡口钳将铝皮密闭，30 C暗处培养&沉积物中主要添加乙酸 钠和Fe(III)8，处理方式见表1。表1沉积物样品的处理条件样品编号加入试剂浓度NaAc乙酸钠6 mg - g-1NaAc+Fe(L)乙酸钠+可溶Fe(L)6 mg*g-1+100 mmolFe(OOH)铁胶铁胶:水= 1:10d2。去离子水24 mL灭菌Ac乙酸钠6 mg -g-1灭菌 Fe(OOH)铁胶铁胶:水=1:10灭菌 dH2O去离子水24 mL1.3分析方法样品中As(L)的浓度采用氢化物发生原子荧光法(AF-610B北京瑞利)测定回,总

9、碑采用ICP-MS (安捷伦7700X)测试& Fe(R)的浓度采用Ferrozine法来测定(TU1900,北京普析)的。样品中CO-用 10 #L微量进样器取样，浓度采用气相色谱测试(GC-960,上海海欣)&测试条件为柱温50 %，热导检 测，载气为Z气&沉积物样品总DNA的提取纯化按照Fast DNA Spin Kit for soil(MP Biomedical USA)的操作说明 进行&对珅的异化还原微生物进行PCR扩增，方法是采用nested PCR，先用引物F8和RGeobacter- aceae-825进行扩增511-127，目的片段在800 bp左右，产物割胶纯化后)PCR

10、，引物用Bacteria specific primers F357GC和R51813，PCR反应的产物用1.5 %琼脂糖凝胶电泳检测。利用DGGE(变性梯度凝 胶电泳)电泳仪系统(DcodeTM, Biorad)分离PCR产物，并克隆测序(上海生工)&分别采用Geobacter- aceae特异引物F494-R8255147和As( V)异化还原菌功能基因引物arrAF 4 -arrAR415进行real-time PCR(ABI Step One Plus)来分析沉积物中Fe(L)和As(V)还原菌的相对丰度&2结果与讨论2.1厌氧环境微生物对沉积物中的释放本实验以尾矿区附近高碑沉积物作为

11、研究对象，在厌氧微环境条件下,考察外加有机碳源乙酸钠、可溶的Fe(L)和不溶的Fe(L)对沉积物中 微生物释放碑的影响，结果见图1。在厌氧环 境下，与无菌控制样品相比,沉积物中碑的迁 移主要是微生物的作用$灭菌样品中碑的释 放相对较少,说明矿物表面解吸不是主要的因 素$沉积物中添加乙酸钠和同时添加乙酸钠及 可溶Fe(L)后,释放到水体中的碑浓度分别为 59.84,61.36 mg-L1,且主要是 As(L)(90 %)$ 从碑随着时间释放的曲线来看，培育前期加入 可溶的Fe(L)会减少碑的释放,后期会增加碑 的释放，但主要影响碑释放的还是乙酸钠的贡 献$只加水的样品中也有一定碑的释放,说明 土

12、著厌氧微生物还可以利用沉积物本身的有广_I.6UJ)S-SH-NaAc f-NaAc+Fe(III)JH2O TFe(OOH)图1/氧条件下微生物对沉积物中碑的释放机碳源进行呼吸代谢$而加入广_I.6UJ)S-SH-NaAc f-NaAc+Fe(III)JH2O TFe(OOH)图1/氧条件下微生物对沉积物中碑的释放样品释放到水体的碑几乎可以忽略,说明Fe(OOH)胶体对微生物释放到水体中的碑有吸附作用,从 灭菌控制样品中也可以看出(见图2),加入Fe(OOH)胶体的样品中释放到水体中的碑的浓度比其它 样品明显低$从图3可以看出,厌氧环境下沉积物中释放碑的同时还有铁的释放，但铁的释放比碑要慢，

13、但图2/氧条件下沉积物中碑的释放(非生物作用)(t_i.5e)sv 一13OI-图3/氧条件下微生物对沉积物中Fe(II)的释放Fe(L)一直都有被还原,图2/氧条件下沉积物中碑的释放(非生物作用)(t_i.5e)sv 一13OI-图3/氧条件下微生物对沉积物中Fe(II)的释放2.2厌氧环境微生物对沉积物中有机碳的转化根据图4可知,在厌氧环境下,外源的有机碳源乙酸钠和Fe(L)都能够促进沉积物中土著微生 物的活性$以有机物作为电子供体产生CO：的贡献大小依次为NaAc+Fe(L)Fe(OOH)NaAcH2。$ 从有机碳的转化可以看出,加入可溶的或不溶的Fe(L)后，。2的浓度显著增加,说明F

14、e(L)的加入 促进了铁还原微生物的生长,异化铁还原明显加强,同时也说明沉积物中铁还原菌非常丰富$表2测序序列比对结果BandPhylogenetic cladeBest matchSimilarity /%18-proteobacteriauncultured Geobacter sp. clone CFC1 (JF736650)9728-proteobacteriauncultured Geobacter sp. Fe_C-85 (AY752781 )9838-proteobacteriauncultured Geobacter sp. ZJ-20d-30(JN091616)9848-pr

15、oteobacteriauncultured Geobacter sp. HZ-10d-140 (HQ875533)9058-proteobacteriauncultured Geobacter sp. MOBA67(JQ079840)956Chloroflexiuncultured bacterium p26f23(FJ479204)967ChloroflexiUncultured Chloroflexi bacterium (AY921935)9188-proteobacteriauncultured soil bacterium OTU80-140(JQ311913)9398-prote

16、obacteriauncultured Geobacter sp. ZJ-5d-16(JN091594)9510Firmicutesuncultured bacterium 1200m_f10(HM745462)96118-proteobacteriauncultured Geobacter sp. GS-11 (JF736631)9712Chloroflexiuncultured bacterium AMAH5(AM935838)9513Chloroflexiuncultured Chloroflexi bacterium g16(EU979025)9514Chloroflexiuncult

17、ured bacterium 0-121 (GU444071)95158-proteobacteriauncultured Geobacter sp. NLS4.19(HQ397218)95168-proteobacteriauncultured bacterium EBL30(GU591522)97178-proteobacteriauncultured bacterium ORSFAM_g03(EF393283)99188-proteobacteriauncultured bacterium ORSFAM_g02 (EF393282)96198-proteobacteriadelta pr

18、oteobacterium AUVE_02E05 (EF650972)99208-proteobacteriaGeobacteraceae bacterium Sd1 -39 (GQ246320)9321FirmicutesClostridium crotonatovorans R6B(AY742899)9922FirmicutesClostridia bacterium SIMO-1715( AY711081)952.3沉积物中功能性微生物分析在厌氧环境下沉积物中铁的呼吸 代谢通常与Geobacteraceae科微生物活 动相关 皿戚。故采用特异引物F8和 RGeobacteraceae-8

19、25对铁还原微生物 进行PCR-DGGE分析。测序结果见表 22.3沉积物中功能性微生物分析在厌氧环境下沉积物中铁的呼吸 代谢通常与Geobacteraceae科微生物活 动相关 皿戚。故采用特异引物F8和 RGeobacteraceae-825对铁还原微生物 进行PCR-DGGE分析。测序结果见表 2。在厌氧环境下，沉积物中有22个优 势菌种,大部分属于!变形菌门，主要 是Geobacter（地杆菌属），另外两个分别 属于绿弯菌门）和Firmicutes（厚壁菌门）。典型铁还原菌Geobacteraceae 在沉积物中丰富，其中大部分优 势种群与有机碳的转化和Fe（L）还原 相关17-23O

20、NaAcNaAc + Fe(III) -Fe(OOH)Time (d)图4不同处理对沉积物中C0产生量的影响注：1-2:加乙酸钠；3-4: Fe(OOH)；5-6:对照行了探讨!基于前面研究发现 厌氧条件下释放出来的碑的 量要大于铁的量，有研究表 明,碑吸附于饱和水铁矿,溶 解1 mol Fe只能释放0.16 mol碑+24。同时二价铁含量较 低，由此推测矿区沉积物中可 能还有能够直接还原As (V 2 的微生物!所以分别考察了有 机碳和Fe( L)在厌氧条件下 对沉积物中Fe( L注：1-2:加乙酸钠；3-4: Fe(OOH)；5-6:对照由图5可知,添加(00H)后,样品中Geobacte

21、raceae科微生物拷贝数上升最多，加入乙酸钠后,样品中Geobacteraceae科 微生物拷贝数也有增加，但没有加入Fe(OOH)多。说明三价铁作为电子供体对样品中Geobacteraceae 科微生物富集的影响更明显。通过DGGE分析也发现添加Fe(OOH)后矿区沉积物中Geobacteraceae 科微生物种类更多。这可能是由于铁胶颗粒较小,有些可能都是纳米级的，纳米颗粒的铁氧化物能 促进微生物对铁的异化还原+25,所以加入铁胶后促进沉积物中异化铁微生物的生长。但正是由于铁 胶颗粒小，比表面积大,使得铁胶对碑有很强的吸附作用,所以迁移到水体的碑很少。铁胶虽然在生 物方面有促进铁还原的作

22、用，但非生物的物理吸附也不可忽视。总之,加入三价铁和乙酸钠后,对 Geobacteraceae科微生物生长有明显促进作用,也再次证实Geobacteraceae科微生物活动对沉积物中碑的释放有重要影响。通过碑的迁移转化数据研究发现，碑迁移出来的最高浓度为61.4 mgL-1，换算迁移的量为73.7 mg-kg-1 %而厌氧环境下铁最高迁移量是37.4 mgkg-1。根据铁碑溶解释放比例(molar ratio As/Fe=0.16) 折算,由于铁溶解释放碑的量只有8.0 mg-kg-1,远低于碑释放的总量,当然还有其他金属氧化物还原 而引起碑的释放，例如4氧化物。不过金属氧化物还原引起的碑的释

23、放主要还是铁4氧化物，因此推 测此矿区沉积中碑的释放还存在其它关键释放机制，例如能够直接还原As(V)的微生物。16s rRNA被 广泛应用于对微生物多样性的检测。然而在微生物生态学中，物种鉴别并不一定与新陈代谢有关。另 一种研究微生物活动的方法就是找寻功能基因。例如对硫还原菌(SRB)来说,大多数研究都致力于 DSR片段的研究，这一成就被用于SRB在耐盐环境中的鉴别。同样的研究发现arrA功能基因是异化碑酸盐微生物(DARPs)还原As(V)可靠的标志26,因此利用功能基因引物arrAF4-arrAR4进行了 PCR 扩增,并对沉积物中异化碑酸盐的微生物丰度进行了荧光定量PCR分析，结果见图6。由图6可知,添加乙酸钠后,沉积物中DARPs功能基因arrA拷贝数显著增加,而加入三价铁后 略有增加，说明乙酸钠主要是富集DARPs。与前面荧光定量PCR分析Geobacteraceae科微生物相比, DARPs功能基因arrA拷贝数要高出一到两个数量级，说明DARPs相对丰度更高，意味着DARPs对 矿区沉积物中碑的释放贡献更大。也就是说沉