PCR检测时对实验室DNA污染的清除

1、1：1 103 103 103 107 107 107 107 107 1：1 103 103 103 107 107 107 107 107 10630 60 120 30 60 120 30 60 1201：10 102 102 102 106 106 106 106 1061：10 102 102 102 106 106 106 106 106 1051：100 10 10 10 105 105 105 105 1041：100 10 10 10 105 105 105 105 104 1041：10001：10000 104 104 104 104 103 1031：10000 0 0

2、 0 103 103 103 102 102 101：10000 0 0 0 103 103 103 102 102 101：100000 0 0 0 10 10 10 10 101：100000 0 0 0 10 10 10 10 103 讨论3 讨论PCR 测定出现假阳性结果通常是由外源性NA 污染所致，病人标本中的病毒颗粒、阳性关于照PCR 测定出现假阳性结果通常是由外源性NA 污染所致，病人标本中的病毒颗粒、阳性关于照NA 或使NANA 结构、阻断NA 的复制。所以经紫外线照射后NA 难以扩增。紫外线照射方便易行，消NA 结构、阻断NA 的复制。所以经紫外线照射后NA 难以扩增。紫外线

3、照射方便易行，消毒面广，关于室内仪器设备影响较小。因此被广泛应用于各实验室消毒。但是紫外线消毒效果毒面广，关于室内仪器设备影响较小。因此被广泛应用于各实验室消毒。但是紫外线消毒效果受灯管的辐射强度、照射时间、微生物的种类、有机物的含量、温度和湿度的影响1,4。受灯管的辐射强度、照射时间、微生物的种类、有机物的含量、温度和湿度的影响1,4。PCR 检测外NA 污染，我们将HBVNA标本和HBV 阳性参控品经低温干燥后，用紫外线照射2 小时，HBVNA 高拷贝数的血清标标本和HBV 阳性参控品经低温干燥后，用紫外线照射2 小时，HBVNA 高拷贝数的血清标HBV种标本随着稀释倍数的增加，经紫外线照

4、射后HBVNA 的下降比例鲜明增加，说明标本中种标本随着稀释倍数的增加，经紫外线照射后HBVNA 的下降比例鲜明增加，说明标本中有机物如蛋白质等含量的高低直接影响到紫外线的照射效果有机物如蛋白质等含量的高低直接影响到紫外线的照射效果HBVNA 阳性血清标本和HBV2 小时后HBVNA紫外线关于HBVNA 阳性的液态标本照射无实际价值。紫外线关于HBVNA 阳性的液态标本照射无实际价值。以上实验结果表明，紫外线关于阳性血清标本造成的实验室污染不能清除；阳性模板经紫外线以上实验结果表明，紫外线关于阳性血清标本造成的实验室污染不能清除；阳性模板经紫外线NA 模板或NAPCRPCR 实验操作规程试验，

5、在操作中应尽量减少各种标本外溢和溅出，以免引起实验室污染，每次实验完毕需认真清洗实验操作台和量减少各种标本外溢和溅出，以免引起实验室污染，每次实验完毕需认真清洗实验操作台和2NA 污染，将直接或可能是不可逆转地影响今后的实验室试验结果。NA 污染，将直接或可能是不可逆转地影响今后的实验室试验结果。参考文献参考文献1 刘怀田，李荣芬。紫外线表面消毒应用研究的进展。中国消毒学杂志，1994；11（1）：1 刘怀田，李荣芬。紫外线表面消毒应用研究的进展。中国消毒学杂志，1994；11（1）：37-3837-382 王占科，祝仲珍。紫外线照射消除PCR 技术外源性NA 污染。人民军医，1997；5：2

6、862 王占科，祝仲珍。紫外线照射消除PCR 技术外源性NA 污染。人民军医，1997；5：2862972973 宋维汉，苏学今，张新秀，等。三种物理方法关于乙型肝炎病毒消毒效果的观察。白求恩医3 宋维汉，苏学今，张新秀，等。三种物理方法关于乙型肝炎病毒消毒效果的观察。白求恩医科大学学报，1998；1：105107科大学学报，1998；1：1051074411（4）：233-23611（4）：233-236防止 PCR 外源性 HBV-NA 污染的实验研究NA84液、过氧乙酸消毒液、次氯酸钠溶液和 2戊二醛消毒液，按常规方法关于高浓度（5107copies/ml ）与低浓度（5103copie

7、s/ml HBVPCRHBVNAHBVNA84HBVNA；过氧HBVNAHBVNA84HBV-NA；高压蒸汽、过氧乙酸、2HBVNA。要害词：乙型肝炎病毒；消毒；方法；聚合酶链反映中图分类号： 文献标识码： 文章编号：The Stuy on the Prevention of External HBV-NA Contamination LIU Jun-quan, CHENG Fu-xing, ZHOU Zhong-hai, ZHANG Yu-xi(epartmentofCentralLaboratory,97thhospitalofPLA,Xuzhou221004,JiangsuProvinc

8、e,China)Abstract: OBJECTIVE To select an optima antisepis to avoi NA contamination uring polymerase chain reaction experiments. METHOS Hepatitis virus B(HBV)NA from serum samples an control samples were antisepsise by six methos, incluing pressche steam; ultraviolet raiation,84-isinfector, peroxie a

9、cetic aci, hypochlirite mareium an 2% glutara lehye isinfector.RESULTSHBV-NAcoulntbeetecteafterbeingealewith84-isinfector,while pressuresteamantisipsishanoeffectsonecreasingNAcontamination.Otherfourmethosha lower efficiency. CONCLUSIONS 84-isinfector is able to clear all the HBV-NA of positive sampl

10、es, while other five methos are not able to.Key wors: Hepatitis B virus; isinfect; methos; Polymerase chain reactionHBV-NA（PC检测具有操作简便、灵敏度高和特异性强等优点。但也常因微量污染而产生假阳性结果。近年来，人们采用了许多方法消毒处理不同的污染环境和污染物NA材料Roche lightcyclerPCR（德国罗氏公司产品）；PCR（深圳匹基生物工程股份有限公司产品）；石英紫外线杀菌灯(30W，1105Wcm2启东市荧光厂生产)；XMG12（连云港千婴医疗设备有限公司）

11、；84（江南消毒剂厂产品）；过氧乙酸（江苏双氧水厂产品）；戊二醛消毒剂（Merck 产品）；次氯酸钠（上海试剂一厂综合经营公司产品）；甘氨酸和硫代硫酸钠（中国医药上海化学试剂公司）。方法1.2.1 乙肝病毒核酸扩增PCR 荧光检测 按试剂盒说明书要求进行 取标本先进行NA然后加入核酸扩增试剂（含PCRTaqUNG）中，HBV酸扩增试剂内，用Roche lightcycler 荧光PCRHBVNA。中和剂的选择 841甘氨酸。 紫外线消毒法 将高浓度（5107copies/ml ）与低浓度（5103copies/ml ）HBVNA 阳性血清标本和HBV（5107copies/ml ）111196

12、 孔细胞培养板中，每孔；置 4冰箱自然干燥后，将标本诀别置于紫外线灯下照射30、60120钟；用亚沸蒸馏水恢复原体积，收集于尖低离心管中即时进行PCR 测定。压力蒸汽消毒法 将浓度为 5107copies/ml 的阳性血清标本置试管中，放入高压灭菌器内进行 123,20min 和 135,10min 加热消毒后即时进行PCR 测定。四种化学消毒剂关于标本的消毒处理 吸取浓度为 5107copies/ml 的阳性血清标本 20 微升，诀别加入经120842000mg/L 28020842h30min的中和剂中和，然后即时进行PCR关于照试验 PCR4阳性血清标本（5107copies/ml) 2

13、0PCR经紫外线照射后HBV-NA1HBV 阳性参控品与相同HBV-NA的照射时间HBV-NA2100HBV-NA1倍；11001HBV-NA倍；而HBV 11100表 1 经紫外线消毒后HBV-NA 含量变化浓度 血清标本（5103copies/ml ） 血清标本（5107copies/ml ） HBV 阳性参控品（5107copies/ml）（稀释倍数） 照射时间（分钟） 照射时间（分钟） 照射时间（分钟） 30 60 120 30* 60* 120* 30 60 1201：1 103 103 103 107 107 107* 107 107 1061：10 102 102 102 106

14、 106 106* 106 105 1041：100 10 10 110 105 105 104* 105 104 1021：10003 104 104 103* 104 1031：10000 0 0 0 103 102 102* 103 102 01：100000 0 0 0 102 1102 10* 10 10 0HBV 与相同稀释倍数的HBV五种消毒法关于HBVNA 阳性血清标本的影响标本经不同消毒方法处理后，84 消毒液能完全清除HBVNA 阳性血清标本中的病毒颗粒， 使 HBVNA 不能检出；过氧乙酸消毒液、次氯酸钠消毒液和戊二醛消毒液及紫外线照射消毒可以减低NA 含量；压力蒸汽消毒

15、法关于HBVNA 无作用，结果见表 2。表 2 HBVNA 阳性血清标消毒前后NA 含量变化 (copies/ml) 消毒方法 消毒前 消毒后 关于照试验 HBV-NA 减少倍数压力蒸汽消毒 123、20min 5107 107 压力蒸汽消毒 135、10min 5107 107 84 消毒液 5106 0 106 5106过氧乙酸消毒液 5106 105 106戊二醛消毒液 5106 106 105次氯酸钠消毒液 5106 105 105PCR 测定出现假阳性结果通常是由外源性NA 污染所致，病人标本中的病毒颗粒、阳性关于照等均是造成实验室严重污染的主要因素。由于HBVNA 是最常见检测项目之一，因此，本文选择该项检测作为消毒效果观察指标。临床常用的化学消毒方法有含氯消毒剂13戊二醛可在4-7。NANANANA1,2；因此，关于外源性NA压力蒸汽消毒是常规