分子生物学基础与基因检测技术-2016年

1、分子生物学基础与基因检测技术-2016年第一页，共40页。基因的基本概念 人体-组织-器官-细胞-细胞核-染色体-DNA-基因基因检测的基本原理和检测技术简介基因芯片技术的优缺点分析和未来发展主要内容第二页，共40页。？。206块骨头、650条肌肉、100多个关节3亿个肺泡，体积为米的十分之一每昼夜跳动十万次，每天排出9000升血液，血管长约9000多公里平均重1.2公斤，体积1.5立方分米，150亿个单元，耗能功率10w，信息容量1015比特大数据第三页，共40页。神奇的人体第四页，共40页。人体九大系统（Nine human body system）消化系统骨骼系统淋巴系统呼吸系统肌肉系统

2、内分泌系统循环系统神经系统生殖系统第五页，共40页。器官（Organ）由几种不同类型的组织联合形成的，具有一定的形态特征和一定生理机能的结构。第六页，共40页。组织（Tissue）由形态相似，结构、功能相同的细胞和细胞间质联合在一起形成的细胞群叫做组织（tissue）上皮组织结缔组织肌肉组织神经组织第七页，共40页。细胞-人体结构和功能的基本单位第八页，共40页。遗传深度压缩的聚合体-染色体第九页，共40页。等位基因，在同一基因座上、但来源不同的同一基因单倍型，是指同一染色体区域中相互连锁的两个不同的基因位点等位基因和单倍型第十页，共40页。生物主要的遗传物质-DNA第十一页，共40页。基因是

3、有遗传效应的DNA片段Gene第十二页，共40页。遗传中心法则（genetic central dogma）第十三页，共40页。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNPs）：单核苷酸多态性指在基因组中不同个体的DNA序列上的单个碱基差异。同一位置上的每个碱基类型叫做一个等位位点。单核苷酸多态性（SNP）第十四页，共40页。甲基化（methylation）第十五页，共40页。胚胎发育早期多处于高甲基化状态甲基化（methylation）第十六页，共40页。人体四种组织：上皮组织、结缔组织、肌肉组织和神经组织细胞是人体结构和功能的基本单位染色体：由DN

4、A和蛋白质构成基因是有遗传效应的DNA片段甲基化是调控基因表达的一种方式小结第十七页，共40页。基因检测的基本原理和检测技术简介基于构象的检测方法测序实时荧光PCR以杂交为基础（基因芯片）内切酶技术光谱和电子信号其他方法，如磁性纳米技术、飞行质谱等第十八页，共40页。双脱氧末端终止法 (Sanger 测序法)1970s 同位素标记，手工1980s 荧光标记，自动1990s 毛细管电泳合成测序法（第二代测序）焦磷酸测序（Pyrosequencing, Roche/454）合成测序（Sequencing-By-Synthesis, Illumina/Solexa）连接测序（Sequencing-B

5、y-Ligation, ABI/SOLiD）单分子测序技术（第三代测序）HelicosPacific BiosciencesOxford Nanopore 测序技术的发展历史第十九页，共40页。测序费用不断降低第二十页，共40页。Sanger法DNA测序的原理双氧核苷三磷酸（ddTBP）作为链终止剂在DNA合成反应混合物的4种普通dNTP中加入少量的一种ddNTP后， 链延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止展开竞争，反应产物是一系列的核苷酸链，其长度取决于从用以起始DNA合成的引物末端到出现过早链终止的位置之间的距离。在4组独立的酶反应中分别采用4种不同的ddNTP，结果将产生4组寡核苷酸，它

6、们将分别终止于模板链的每一个A、T、C和G的位置上。动画演示第二十一页，共40页。测序的原理是DNA链终止法，这注定了一个反应所测序列不可能太长，目前为1000个核苷酸左右。测序反应费时费力测序准确度不高结构复杂的难于进行PCR反应的片段不能测序。一代测序技术的缺点第二十二页，共40页。第二代测序技术第二代测序技术循环阵列合成测序法新一代测序技术（Next Generation Gequencing，NGS）代表技术为罗氏公司(Roche)的454测序仪(Roche GS FLX sequencer) （2005）Illumina公司的Solexa基因组分析仪(Illumina Genome

7、Analyzer)ABI的SOLiD测序仪(ABI SOLiD sequencer)（2007）动画演示第二十三页，共40页。实时荧光定量PCR实时荧光定量 PCR ( real-time fluorogenetic quantitative PCR , RQ-PCR) 是在 PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术它是一种在PCR反应体系中加入荧光基团 , 利用荧光信号积累实时监测整个 PCR进程 , 最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法实时荧光 PCR的分类：标记方法：荧光标记探针（Taqman）；双链 DNA ( dsDNA) 结合染料SYBRgreen检测基因表达：绝对定量；

8、相对定量检测SNP：ARMS-PCR；HARM第二十四页，共40页。扩增阻滞突变系统多聚链酶式扩增(ARMS-PCR)第二十五页，共40页。HRM进行SNP检测原理高分辨率融解曲线(HRM) 是一种分析DNA融解曲线的新方法.第二十六页，共40页。生物芯片将大量探针分子固定于支持物上后与带荧光标记的DNA或其他样品分子（例如蛋白，因子或小分子）进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。第二十七页，共40页。生物芯片被动式芯片主动式芯片基因（DNA）芯片蛋白质芯片微流控芯片：样品制备芯片、聚合酶链反应（PCR）芯片、毛细管电泳芯片和色谱芯片 cDNA芯片寡核苷

9、酸芯片组织芯片细胞芯片芯片实验室：样品制备、试剂输送、生化反应、结果检测、信息处理和传递等一系列复杂工作 生物芯片分类第二十八页，共40页。将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段有规律地排列固定于支持物（如膜、硅片、陶瓷片及玻片）上，然后通过类似于Northern，Southern的方法与待测的标记样品按碱基配对原理进行杂交，再通过检测系统对其进行扫描，并用相应软件对信号进行比较和检测，得到所需的大量信息，进行基因的高通量、大规模、平行化、集约化的信息处理和功能研究。基因芯片第二十九页，共40页。基因芯片优势比较疾病状态下不同时间点基因表达的差异对复杂疾病的鉴定药物发现和药物毒性测试病原微生物分析

10、多位点SNP分析第三十页，共40页。人类的疾病与遗传基因密切相关，基因芯片可以对遗传信息进行快速准确的分析，用于分子诊断是临床研究中一种新的、强有力的分子工具。 遗传病相关基因的定位 肿瘤诊断 感染性疾病的诊断耐药菌株和药敏检测 疾病的诊断和治疗第三十一页，共40页。DNA芯片第三十二页，共40页。微流控芯片（microfluidic device）微流控是指在一个微小系统中对微量液体进行控制操作。最为人们熟知的微流控技术的应用是喷墨打印。第三十三页，共40页。微流控芯片（第二代生物芯片）是微阵列芯片（第一代生物芯片）的延伸微阵列芯片具有快速，高信息量的优点，但至今广泛使用上仍受限制，除价格因

11、素外（只有建立在大样本量的基础上才能够适当降低成本），样品制备的复杂繁琐是妨碍其广泛使用的主要原因。微流控芯片，把前置处理过程微缩在芯片上，目的是把实验微型化，最终制成芯片实验室（lab-on-a-chip）有了它，就可以告别步骤繁复，仪器杂乱的实验室。微流控芯片（microfluidic device）第三十四页，共40页。进一步提高探针阵列的集成度 。 提高检测的灵敏度和特异性。 高自动化、方法趋于标准化、简单化，成本降低。 高稳定性。 研制新的应用芯片。 研制芯片新检测系统和分析软件，以充分利用生物信息。 芯片技术将与其它技术结合使用，如基因芯片PCR、纳米芯片 。不同生物芯片间综合应用

12、，如蛋白质芯片与基因芯片间相互作用等，可用于了解蛋白质与基因间相互作用的关系。 基因芯片技术未来方向 第三十五页，共40页。变性高效液相色谱分析荧光原位杂交一代测序等位基因特异性PCR二代测序荧光PCR转录介导扩增法单链构象多态性PCR多重PCR巢式PCR限制性片段长度多态性基因芯片重组酶介导扩增法第三十六页，共40页。选择合适的方法至关重要第三十七页，共40页。方法选择的影响因素费用 目的用途 特异性 标本类型方法选择 灵敏度第三十八页，共40页。方法 PCR 测序 芯片背景针对科研需求:低拷贝基因的扩增满足科研需求:全基因组未知序列测定满足检测需求:已知序列的再验证特点高灵敏度广泛用于临检标准化成熟灵敏度适中临检叫停需规范标准化灵敏度适中已用于临检标准化趋于成熟局限影响