体内药物分析 手性药物HPLC法课件

1、第10章 手性药物的 高效液相色谱拆分法 空间结构不能重叠，互为镜像关系的立体异构体为对映体异构体，简称对映体（enantiomer），相应的药物称为手性药物。第一节、概述P 2701 偏振光和比旋光度 光是一种电磁波，光波的振动方向与光的前进方向垂直。 如果让光通过一个象栅栏一样的 Nicol 棱镜 (起偏镜)就不是所有方向的光都能通过，而只有与棱镜晶轴方向平行的光才能通过。这样，透过棱晶的光就只能在一个方向上振动，象这种只在一个平面上振动的光，称为平面偏振光，简称偏振光或偏光。 2 那么，偏振光能否透过第二个Nicol 棱镜 (检偏镜) 取决于两个棱镜的晶轴是否平行，平行则可透过；否则不能

2、通过。如果在两个棱镜之间放一个盛液管，里面装入两种不同的物质：3结论： 物质有两类： （1）旋光性物质能使偏振光振动面旋转的性质，叫做旋光性；具有旋光性的物质，叫做旋光性物质。 （2）非旋光性物质不具有旋光性的物质，叫做 非旋光性物质。 旋光性物质使偏振光旋转的角度，称为旋光度，以“”表示。4 旋光仪 polarmeter： 定量测量液体或溶液的旋光程度的仪器 在有机化学中，凡是手性分子都具有旋光性，而非手性分子则没有旋光性。5具有镜像与实物关系的一对旋光异构体。 对映异构体 (S)-(+)-乳酸 (R)-(-)-乳酸 ()-乳酸 mp 53oC mp 53oC mp 18oC D=+3.82

3、 D=-3.82 D=0 pKa=3.79(25oC) pKa=3.83(25oC) pKa=3.86(25oC)151515外消旋乳酸比旋光度7对映体的命名 RS命名原则（1）按次序规则排出各取代基的顺序ABCD原子序数大小规则序数大的原子优先同位素规则原子量大优先外推规则层层外推，先比较最大的d. 相当规则重键看作多个单键如：C=C2 等（2）方向盘法： 最小基团D放在操作杆上， 从D的对面看，顺时针为R,反时针为S.药物分子的手性标记通常采用R/S序列标记法。8 同时，手性也是生物体系的基本特征。人体内糖的构型为D-构型，氨基酸为L-构型，因此，内源性的大分子物质如蛋白质、酶、载体、受体

4、、糖蛋白、多糖、核酸等都具有手性特征。手性药物的作用机制： 从立体化学角度看，手性药物的2个对映体实际上是2种完全不同的药物。它们通过与体内大分子的不同立体结合，可产生不同的吸收、分布、代谢和排泄过程，从而导致药物动力学参数的变化。由于手性药物的两个对映体的体内药动学过程不同，而可能具有不同的药理和毒理作用，甚至药效拮抗，也可能其中一个对映体导致了药物不良反应。？反应停不良反应？(S)-thalidomide 致畸10 手性药物的药理作用是通过与体内大分子之间的严格手性匹配与分子识别而实现的，也就是在人体内药物通过与具有特定物理形态的受体反应起作用。药物的两种立体异构体中，只有一种更适合与受体

5、或活性部位结合，从而抑制（或激动）该大分子的生理活性，达到治疗的目的。药效11 手性药物与生物体系相互作用具有立体选择性，可引起药理学差异，即药理学立体选择性。药理学立体选择性分为药效学立体选择性(stereoselectivity in pharmacodynamics)和药代动力学立体选择性(stereoselectivity in pharmacokine-tics)。宫丽 综述12反应停所引起的不良反应14(S)-thalidomide 致畸(R)-thalidomide 镇静FDA (U.S. Food & Drug Administration) To patent new dru

6、gs needs full documentation of the pharmacological profiles of the individual enantiomers as well as their combinations. 1984年荷兰药理学家Ariens极力提倡手性药物以单一对映体上市，抨击以消旋体形式进行药理研究以及上市。他的一系列论述的发表，引起药物部门广泛的重视。15 自从1992年美国FDA开始要求手性药物以来，手性药物在研发的新药中所占比例逐年增加，据市场统计1993年单一对映体药物的销售额为350亿美元，2000年全球销售额达到1 330亿美元，预计2008年

7、达到2 000亿美元。 手性药物以单纯对映体形式上市，可减少治疗总剂量，减少药物间相互作用，消除无活性对映体的毒性。 合成手性药物的方法主要有化学合成法和生物合成法两种。17 上世纪60年代初，科学家们开始研究在极少量的手性催化剂作用下获得大量的单旋体，这就是手性合成技术。最初只获得了3%的收率，经过近三十年的努力终于获得了成功。目前最高的产率已经接近100%，特别需要指出的是这种技术可以使人们随心所欲地合成自然界中不存在的左旋体或右旋体。 比如除草剂Metolachlor，其左旋体具有非常高的除草性能，而右旋体不仅没有除草作用，而且具有致突变作用，每年有2000多万吨投放市场，其中1000多

8、万吨是环境污染物。Metolachlor自1997年起以单旋体上市，10年间少向环境投放约1亿吨化学废物。18 因此，若以消旋体药物给药，在研究药物对映体的药效、毒性及药动学性质时，应分别对单个光学异构体进行测定。如果采用传统、非立体选择性药物分析方法测定生物体液中药物对映体，以评价其药理行为，会得出不全面甚至错误的结论。所有这些都要求建立高专属性、高灵敏度、高分离度的对映体拆分和测定方法。19 对映体化合物之间除了偏振光的偏转方向不同外，其他理化性质完全相同，因而在非手性环境中基本无法分离。 创造手性环境，构造非对映异构体是实现手性拆分的基础色谱法分离手性药物对映体的方法有：间接法直接法 手

9、性固定相法 CSP 手性流动相法 CMP创造手性环境构造非对映异构体20第二节 手性分析的方法一、间接法 又称柱前衍生化法，是药物对映体（不能说外消旋体）在用HPLC分离前，先与具有高光学纯度的手性衍生化试剂（CDR）反应，在药物对映体中引入第二个手性中心，形成非对映异构体，其理化性质就有较大的差异，因而可在普通固定相（非手性固定相）上实现分离 （R）SE + (R) SA (R)SE(R) SA (S) SA (R)SE(S) SA211.衍生化反应注意事项：（1）手性试剂必须是高光学纯度试剂，同时为了保证分析方法的准确性，衍生化反应需定量完成（90-100%）（2）手性待测物必需具有可反应

10、的活泼基团如氨基、醇基、羧基，以保证与CDR反应完全。（3）手性试剂及反应产物在化学上和手性上都要稳定 （4）所生成的非对映体在色谱分离时应有较高的柱效（5）在选择手性衍生化试剂时，应同时考虑使生成的非对映异构体具有良好的检测特性，故手性试剂应具有紫外或荧光等可检测基团。22（3）羧酸衍生物类 主要包括酰氯与磺酰氯类、酸酐类和率甲酸酯类。它们的手性碳位于羧基的位，可与胺、氨基酸及醇类药物反应生成非对映异构体衍生物。（4）胺类 主要用于衍生化羧酸类、N-保护氨基酸、醇类药物（5）测定体液中低浓度的药物对映体时，采用高灵敏度的荧光CDR24手性衍生化法的特点优点只需使用价格便宜、柱效较高的非手性柱

11、衍生化可提高灵敏度缺点需要柱前衍生化，操作复杂衍生化试剂要求高的光学纯度衍生化反应速率重现性较差25酮洛芬对映体的柱前衍生化示意图 S-萘乙胺27酮洛芬对映体的柱前衍生化方法酮洛芬对照品溶液(1 mg/mL)0.1 mL加入正己烷0.6 mL二氯亚砜溶液0.2 mL751 h冷却至室温吹干后加入S-NEA溶液0.2 mL5 min振摇加入2.0 mol/L H2SO4 0.5 mL混匀吹干后溶解进样二氯甲烷:乙醚2:128色谱条件色谱柱：Hypersil C18, 5 m, 1505.0 mm ID， 流动相：乙腈水-乙酸-三乙胺(55 : 45 : 0.1 : 0.02，v/v)，流速： 1

12、 ml/min, 检测波长：254 nm29酮洛芬对映体衍生化物色谱图RS酮洛芬对映体衍生化物的保留时间为tR=7.3 min，tR=8.5 min，分离度为1.930二、直接法 是在HPLC系统中引入“手性识别器”或手性环境，以形成暂时的非对映异构体复合物，根据其形成复合物的稳定系数不同而获得分离。理论基础： Dalgliesh于1952年“三点相互作用”（three-point interaction)理论，在一对对映体和手性选择剂之间，为了形成稳定性不同的非对映体分子络合物而达到手性分离的目的，至少需要三个分子之间的相互作用部位，其作用力包括氢键相互作用包结络合作用-电荷转移相互作用立体

13、契合作用过渡金属离子的手性配位相互作用。31提供手性环境，通过手性识别进行分离32（一）手性流动相法 CMP 在流动相加入手性添加剂（CMPA），使其与待测物形成非对映异构体复合物，根据其形成复合物的稳定常数的不同而得以分离。直接法常用的手性添加剂环糊精添加剂手性离子对试剂配基交换型手性添加剂331.环糊精添加剂（一）手性流动相法 CMPcyclodextrins，CD可分为、三类，它们分别由6，7，8个D-吡喃葡萄糖通过-1，4羟基连接。每个葡萄糖单元有5个手性碳原子。 CD的手性识别主要来自环内腔对芳烃或脂肪烃侧链的包容作用及环外壳上的羟基与药物对映体发生氢键作用。-CD及其改性CD因具有

14、最佳大小的内腔，因而广为使用342.手性离子对色谱法（一）手性流动相法 CMP 是一类用于分离可解离对映体的离子对色谱法，已成功分离了-氨基醇类、氨基醇类、胺类等对映体化合物。常用手性反离子有奎尼，奎尼丁、10-樟脑磺酸等。 3.配基交换型手性添加剂在流动相缓冲溶液中加入金属离子和配位体交换剂形成二元络合物，药物对映体再与其形成稳定性不同的三元络合物而达到手性分离。常用手性配基为光学活性氨基酸及其衍生物的二价金属离子螯合物。它们 和手性药物形成非对映异构配位络合物对。35特点可采用普通的非手性固定相不需对样品进行衍生化手性添加物的可变范围较宽36 -环糊精手性流动相添加剂法拆分佐匹克隆对映体徐

15、颖 药学进展 2006 第9期佐匹克隆（zopiclone）是第三代吡咯酮类速效催眠药色谱柱：Zorbax Rx C18柱（ 4.6x250mm，5 m）；流动相为0.12mol/L的磷酸盐缓冲液-甲醇（7525，V/V），其中含9 mmol/L 的-环糊精；PH6.0，流速为0.8ml/min；检测波长305 nm；进样量20L；柱温为20。37 手性固定相是在色谱柱的担体上加上高光学纯度的手性异构体制作而成。采用手性固定相的HPLC法可以直接、快速、有效、简便地分离大多数手性物质对映体。直接法（二）手性固定相法 CSP目前，以商品出售的手性固定相有100种左右但手性柱极其昂贵381.电荷转

16、移型手性固定相（小分子型）手性固定相 是指分子中具有吸电子基团（如硝基）或斥电子基团（如氨基、烷基、烷氧基、萘环）并且能够与对映体发生电荷转移作用而达到拆分目的的一类手性固定相。 Pirkle 型手性固定相是目前使用量大、适用面广、对手性识别机理揭示较深的一类重要CSP。这类固定相研究主要贡献应归功于美国Illinois大学的Pirkle W H 研究组，故称Pirkle 型手性固定相 -碱型（有斥电子取代基）Pirkle 型手性固定相：拆分大量-酸的胺、氨基酸、亚砜类等对映体。 -酸型（有吸电子取代基）Pirkle 型手性固定相：拆分多种带烷基、醚基、氨基取代的芳香环类对映体。39常用的有：

17、牛血清蛋白（BSA）和人血1-酸性糖蛋白(AGP)键合硅胶手性固定相2. 蛋白质类手性固定相手性固定相 蛋白质是一类高分子聚合物，所含L-氨基酸具有手性特异性，可与药物对映体在蛋白质结合位点进行手性识别而达到分离。此类键合相以离子键或共价键以及蛋白交联作用将蛋白质固定到硅胶上。 此类固定相的应用范围较广，拆分效果好，但其色谱柱容量小；常用的流动相为磷酸盐缓冲液pH4-7，离子强度为0-500mmol/L，有机改性剂不得超过5%。40手性固定相3.多糖及其衍生物类手性固定相 每个葡萄糖单元含有5个手性中心，以及一个伯羟基和2个仲羟基，通过对其化学改性可以得到一系列衍生物。 多糖及其衍生物类手性固

18、定相可细分为纤维素衍生物类、纤维素氨基甲酸酯类及直链淀粉类 此类固定相的优越之处在于：良好的稳定性，制柱简单，无需键合，适用于多种手性药物的拆分。41手性固定相4.环糊精类手性固定相 将环糊精或其衍生物通过共价键键合到载体上便得到环糊精手性固定相5.大环类抗生素手性固定相 大环类抗生素为多手性中心、多官能团的化合物，可通过多种属性识别机制进行识别，是一种高效的手性选择固定相。 大环抗生素具有疏水作用、偶极-偶极作用、-作用、氢键作用、和立体排阻作用，常用于手性拆分的大环抗生素主要有糖肽类、安莎霉素类、氨基糖苷抗生素42手性固定相 6.冠醚类手性固定相 冠醚与环糊精类似，是本身具有手性的低聚糖。冠醚类化合物有亲水性内腔和亲脂性外壳，可键合在硅胶或聚苯乙烯基质上制成手性固定相，与金属离子、氨基阳离子等