中药制剂检测技术 第七章 中药制剂检测新技术课件

1、第一节 毛细管电泳法第二节 中药指纹图谱第三节 电感耦合等离子体质谱法第七章 中药制剂检测新技术纪从兰老师编写 毛细管电泳法（CE）又称高效毛细管电泳（HPCE），是20 世纪80年代发展起来的一类高效快速的分离分析方法，是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物。 第一节 毛细管电泳法毛细管电泳仪一、概述 （一）基本原理 以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据供试品中各组分的淌度(单位电场强度下的迁移速度)和(或)分配行为的差异而实现各组分分离的一种分析方法。第一节 毛细管电泳法电渗流（二）特点 高效 低耗 快速 广谱第一节 毛细管电泳法HPCE与HPLC的比较 1. 柱效更

2、高，理论板数可达105106/m，主要是由于该法无固定相，不存在传质差异，整个流体就像塞子似的以匀速向前流动。2. 分析速度更快，几十秒至十几分钟内即可完成一个试样的分析。3.溶剂和样品消耗极少，样品用量仅为纳升（nl）级。不需高压泵输液，毛细管价格低廉，因此工作成本更低。4.通过改变操作模式和缓冲溶液的成分，该法有很大的选择性，可对各种成分进行有效的分离。例如，中性有机分子、无机离子、蛋白质等高分子化合物，甚至整个细胞或病毒。第一节 毛细管电泳法HPCE和HPLC柱中溶液流型的比较 2.毛细管凝胶电泳（CGE） 该法在毛细管中装入单体和引发剂引发聚合反应生成凝胶，该方法主要用于分析蛋白质、D

3、NA等生物大分子。另外还可利用聚合物溶液，如葡聚糖等的筛分作用进行分析，称为毛细管无胶筛分。有时将它们统称为毛细管筛分电泳，下分为凝胶电泳和无胶筛分两类。第一节 毛细管电泳法 3. 毛细管等速电泳(CITP) 该法采用前导电解质和尾随电解质，在毛细管中充入前导电解质后，进样，电极槽中换用尾随电解质进行电泳分析，带不同电荷的组分迁移到各个狭窄的区带，然后依次通过检测器。4. 毛细管等电聚焦电泳(CIEF) 将毛细管内壁涂覆聚合物减小电渗流，再将样品和两性电解质混合进样，两个电极槽中分别加入酸液和碱液，施加电压后，毛细管中的操作电解质溶液逐渐形成pH梯度，各溶质在毛细管中迁移至各自等电点（pI）时

4、变为中性，形成聚焦的区带，而后用压力或改变检测器末端电极槽储液的pH值的办法使溶质通过检测器。第一节 毛细管电泳法毛细管等电聚焦分离示意图 对于常用的阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS），进样后极强亲水性组分不能进入SDS胶束，随操作缓冲液流过检测器（容量因子k=0）；极强憎水性组分则进入SDS胶束的核中不再回到水相，最后到达检测器（k=）。第一节 毛细管电泳法 MECC的分离原理示意图二、仪器设备（一）毛细管电泳仪的基本结构 第一节 毛细管电泳法 1.电极槽和进样系统 2.清洗系统 3.毛细管 4.检测器 5.铂电极 6.电极槽 7.恒温系统 8.记录和数据处理6. 毛细管电色谱(CEC

5、)该法是在毛细管电泳技术不断发展和液相色谱理论日益完善的基础上逐渐兴起的。它是将细粒径固定相填充到毛细管中或在毛细管内壁涂覆固定相以电渗流驱动操作缓冲液（有时再加辅助压力）进行分离的，包含了色谱和电泳两种机制，其中以色谱为主，但对荷电溶质兼有电泳作用。 第一节 毛细管电泳法 2.直流高压电源 一般采用030kV（或相近）可调节直流电源，可供应约300A电流，具有稳压和稳流两种方式可供选择。第一节 毛细管电泳法3. 电极和电极槽 两个电极槽里放入操作缓冲液，分别插入毛细管的进口端与出口端以及铂电极，铂电极接至直流高压电源，正负极可切换。多种型号的仪器将样品瓶同时用做电极槽。 4.冲洗进样系统 每

6、次进样之前毛细管要用不同的溶液冲洗，选用自动冲洗进样仪器较为方便。进样方法有压力进样、负压进样、虹吸进样和电动进样等。进样时通过控制压力、电压或时间来控制进样量。第一节 毛细管电泳法5. 检测系统紫外检测器，荧光检测器，电化学检测器，质谱仪等均可作为CE的检测器。其中紫外检测器应用最广，它是将毛细管接近出口端的外层聚合物剥去约2mm一段，使石英管壁裸露，毛细管两侧各放置一个石英聚光球，使光源聚焦在毛细管上，透过毛细管到达光电池对溶质进行检测。第一节 毛细管电泳法三、基本操作（一）准备工作按照仪器操作手册开机，预热，输入各项参数，如毛细管温度、操作电压、检测波长、冲洗程序等。操作缓冲液须过滤和脱

7、气。冲洗液、缓冲液等放置于样品瓶中，依次放入进样器。第一节 毛细管电泳法（二）毛细管的处理毛细管处理的好坏对测定结果影响很大。未涂层新毛细管要用较浓碱液在较高温度（例如1mol/L氢氧化钠液在60）冲洗，使毛细管内壁生成硅羟基，再依次用0.1mol/L 氢氧化钠、水、 操作缓冲液冲洗分数分钟。两次进样中间可仅用缓冲液冲洗，但若发现分离性能改变，则开始用0.1mol/L氢氧化钠冲洗，甚至要用浓氢氧化钠液升温冲洗。第一节 毛细管电泳法（三）进样测试 将待测样品溶液瓶置于进样器中，设定操作参数，如进样压力（电动进样电压）、进样时间、正极端或负极端进样、操作电压或电流、检测器参数等，开始分析。根据初试

8、的电泳谱图调整仪器和操作缓冲液以获得优化结果。而后用优化条件正式分析。第一节 毛细管电泳法（四）数据处理 有关CE的计算方法、公式等可参照中国药典高效液相色谱法的有关规定，将保留时间（tR）改为迁移时间(tm)即可。（五）结束工作 分析完成后用水冲洗毛细管，注意将毛细管两端浸入水中保存，如果长久不用应将毛细管用氮吹干，最后关机。第一节 毛细管电泳法（六）注意事项 由于进样方法的限制，目前毛细管电泳的精密度比用定量阀进样的高效液相色谱法差，故定量测定以采用内标法为宜。用加压或减压法进样时，样品溶液黏度会影响进样体积，应注意保持试样溶液和对照品溶液黏度一致。用电动法进样时，被测组分因电荷不同的电歧

9、视现象和溶液离子强度会影响待测组分的迁移量，也要注意其影响。第一节 毛细管电泳法 四、系统适用性试验目的在于考察所配置的毛细管分析系统和设定参数是否适用。系统适用性测试项目和方法与高效液相色谱法或气相色谱法相同，相关计算和要求也相同。第一节 毛细管电泳法（一）仪器与试剂 Unimicro毛细管电泳仪 毛细管60cm（有效长度45cm）75m 没食子酸对照品 肉桂酸对照品 95%乙醇 硼砂（分析纯） 去离子水 市售山茱萸 六味地黄丸（水蜜丸）第一节 毛细管电泳法（二）实验条件 操作缓冲溶液为20mmol/L硼砂溶液 检测波长271nm 重力进样（10cm5s） 工作电压20kV 电泳温度20 每

10、次运行前依次用0.1mol/L氢氧化钠溶液、去离子水、操作缓冲溶液冲洗3min。第一节 毛细管电泳法2山茱萸供试品溶液的制备 将山茱萸药材剪碎，称取5g，加95%乙醇50ml，浸泡12小时，加热回流提取2小时，过滤，滤渣重复提取2次，合并提取液，减压浓缩至10ml。 移至50ml量瓶中，加95%乙醇稀释至刻度，摇匀，精密量取2ml并加入内标溶液1ml，95%乙醇稀释定容至5ml，摇匀，即得。3六味地黄丸供试品溶液的制备 取六味地黄丸粉碎后，称取5g，提取方法同山茱萸药材，减压浓至10ml，以下操作同山茱萸供试品溶液的制备，即得。第一节 毛细管电泳法（四）系统适用性试验 在山茱萸的测定中，没食子

11、酸的理论板数n=179820，在六味地黄丸的测定中，没食子酸的理论板数n=167388，没食子酸与周围组分分离良好，无干扰组分存在。第一节 毛细管电泳法山茱萸、六味地黄丸样品和对照品的电泳图谱 山茱萸（A）、六味地黄丸（B）和对照品（C）的电泳图谱 (1.肉桂酸；2.没食子酸）第一节 毛细管电泳法（五）方法学考察线性范围 精密量取没食子酸对照品溶液0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6mL、0.8ml、1.0ml、2.0ml于5ml量瓶中，各加入肉桂酸内标液1mL，95%乙醇定容至刻度，以没食子酸对照品峰面积与内标物峰面积的比值对其质量浓度作图，其线性回归方程为Y=0.0167X+0.13

12、33，相关系数r=0.9993（n=7）。精密度 山茱萸和六味地黄丸峰面积的RSD分别为2.9%和2.1%（n=5）准确度 山茱萸和六味地黄丸加样回收率分别为97.4%98.6%和99.3%102.4%。第一节 毛细管电泳法（六）样品中没食子酸的含量测定 取山茱萸供试品溶液和六味地黄丸供试品溶液分别测定，山茱萸中没食子酸含量为0.225%；六味地黄丸中没食子酸的含量为0.055%。第二节 中药指纹图谱 中药指纹图谱（fingerprints of Traditional Chinese Medicine）是指中药材、饮片及其制剂经适当处理后，采用一定的分析方法与技术所精力的能够标识其化学特征的

13、色谱图或光谱图。特点：中药指纹图谱是一种综合的，可量化的检验技术，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药及其制剂质量的真实性、优良性和稳定性。“整体性”和“模糊性”为其显著特点。第二节 中药指纹图谱一、指纹图谱的分类（一）按研究与应用对象分类中药材指纹图谱中药原料（包括饮片、中药提取物）指纹图谱中间体（工艺生产过程中的中间产物）指纹图谱以及中药制剂指纹图谱。（二）按研究方法、手段分类中药化学指纹图谱中药生物学指纹图谱第二节 中药指纹图谱二、中药指纹图谱建立的原则和研究思路（一）中药指纹图谱建立的原则 中药指纹图谱的建立，应以系统的化学成分研究和药理学研究为依托，体现系统性、特

14、征性和稳定性三个基本原则。第二节 中药指纹图谱1系统性 是指指纹图谱中反映的化学成分应包括该中药有效部位所含大部分成分，或指标性成分的全部，如中药两头尖中抗肿瘤的有效成分为皂苷类化合物，则其指纹图谱应尽可能地反映其中的皂苷类成分；银杏叶的有效成分是黄酮类和银杏内酯类，则其指纹图谱可采用两种方法，针对这两类成分分别分析，达到系统全面的目的。2特征性 是指指纹图谱中反映的化学信息（如保留时间）应具有较强的选择性，这些信息的综合结果，将能特征性地区分中药的真伪与优劣，成为中药自身的“化学条码”。 3稳定性 是指所建立的指纹图谱在规定的方法、条件下的耐用程度，即不同操作者、不同实验室所重复做出的指纹图

15、谱应在所允许的误差范围内，以体现其通用性和实用性。因而要求包括样品制备、分析方法、实验过程、数据采集、处理、分析等全过程都要规范化操作，同时，还应建立相应的评价机构，对其进行客观评价。第二节 中药指纹图谱第二节 中药指纹图谱 （二）中药指纹图谱研究思路 中药指纹图谱构建的一般程序包括：设计方案、样品采集、方法建立、数据分析、样品评价、方法检验和建立标准指纹图谱及其技术参数。中药指纹图谱构建思路示意图第二节 中药指纹图谱 中药指纹图谱的建立可针对不同用途，选用不同的分析方法。如对于药品进行质量控制，应考虑生产企业和药检部门常规配备的仪器，方法耐用，一般以光谱法、气相色谱法和高效液相法为主。若用于

16、配伍理论或新药研究，特别是化学成分与药理、药效相关性研究，可考虑联用技术。方法检验室是在方法确立后的一段时间内对更多未知样品进行检验分析，进一步考察方法的可行性和耐用性。第二节 中药指纹图谱 天然药物指纹图谱技术是世界范围内被广泛认可的质量控制手段。英国草药典(1996)、印度草药典(1998)、加拿大药用及芳香植物学会、德国药用植物学会、WHO草药评价指南(1996)、美国草药典(19992001,Monographs)均接受色谱指纹图谱。美国食品和药品管理局(FDA)于2000年8月发布的“植物药产品行业指南(征求意见草案)”中,指出特定植物药品种用色谱指纹图谱来进行质量控制是可以接受的。

17、我国食品药品监督管理局(SFDA)于2000年发布了“中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)”,首次以中药指纹图谱作为中药质量标准的一个新概念列入了药品管理法规。知识链接第二节 中药指纹图谱三、中药色谱指纹图谱建立的方法与技术要求(一)样品的收集 为了确保指纹图谱的系统性，必须广泛收集具有代表性的样品。一般要求不少于10批样品的收集数量（药材的批次是指不同产地、不同渠道或不同时间获取的独立样品，与成品的批次不同，要注意区分），每批供试品中取样量应不少于三次检验量，同时要有详实记录。第二节 中药指纹图谱原药材尽可能固定产地(来自GAP基地药材或地道药材)、采收期、炮制方法。对光线稳定，疗效稳定

18、，无临床不良反应的药材批次应重点选择。还应收集不同产地、不同采收期的药材，以便进行指纹图谱的比较研究。中间体、注射剂样品的收集应重点选择工艺稳定，疗效恒定，无不良反应的批次。留样应不少于实验用量的3倍。第二节 中药指纹图谱（二）供试品溶液的制备 供试品制备的每一步骤均必须标准化操作，以保证样品分析具有良好的精密度、重现性、准确性及样品间的可比性，主要操作过程及数据应详细记录。（三）参照物的制备一般选取样品中容易获得且含量较高的一个主要活性成分或指标成分作为参照物。参照物主要用于指纹图谱技术参数的确定，如特征峰（共有峰）的相对保留时间，峰面积比值等；并有助于图谱的稳定性、重现性的考查。第二节 中

19、药指纹图谱（四）实验方法和条件的选择中药指纹图谱的建立与应用关键在于分析方法，包括测定方法、仪器、试剂、测定条件等，应根据分析试样中所含化学成分的理化性质选择适宜的测定方法。以色谱法最常用，一般首选HPLC法，对于易挥发性成分选用GC法，对于生物大分子可采用凝胶色谱法、CE或HPLC-MS；对于成分复杂的试样，必要时可以考虑采用多种测定方法，建立多个指纹图谱。第二节 中药指纹图谱（五）中药指纹图谱的方法验证1精密度试验主要考察仪器的精密度。2重现性试验主要考察实验方法的重现性。3稳定性试验主要考察供试品的稳定性。第二节 中药指纹图谱（六）色谱指纹图谱的建立和辨认试验条件确立后，将获得的所有样品

20、的指纹图谱逐一研究比较，首先找出药材色谱具有指纹意义的各个峰，给以编号，将药材、半成品和成品之间的图谱比较，如有缺峰，则缺号，要保持峰的编号不变，便于清楚地考察相互之间的相关性。指纹图谱的辨认应注意指纹特征的整体性。第二节 中药指纹图谱（七）指纹图谱的校验与复核应对所建立的指纹图谱按有关规定要求进行实验条件、方法及结果的校验与复核。（八）指纹图谱的分析与评价根据指纹图谱所获取的信息，建立指纹图谱分析比较的重要参数（共有峰、重叠率、N强峰、特征指纹等），计算特征指纹的相似度，进行指纹图谱的评价。请分析指纹图谱技术与传统的定性及定量分析方法有何显著差异?分析色谱及光谱技术在指纹图谱研究中地位差异？

21、作为指纹图谱原始数据的获取来源，紫外光谱法存在哪些优劣方面？课堂互动第三节 电感耦合等离子体质谱法 电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）是将被测物质用电感耦合等离子体离子化后，按离子的质荷比分离，用于元素和同位素分析以及元素价态分析的一种新方法。一、仪器组成及其工作原理进样系统电感耦合等离子体（ICP）离子源接口及离子光学系统质量分析器和检测器第三节 电感耦合等离子体质谱法二、仪器与试剂电感耦合等离子体质谱仪微波消解仪洗瓶及量瓶标准溶液第三节 电感耦合等离子体质谱法三、操 作 方 法（一）标准品储备液的制备分别精密量取铅、砷、镉、汞、铜单元素标准溶液适量，用10硝酸溶液稀释制成每1ml分别含

22、铅、砷、镉、汞、铜为1g、0.5g、1g、1g、10g的溶液，即得。第三节 电感耦合等离子体质谱法（二）标准品溶液的制备精密量取铅、砷、镉、铜标准品储备液适量，用10硝酸溶液稀释制成每1ml含铅、砷0ng、1ng、5ng、10ng、20ng，含镉0ng、0.5ng、2.5ng、5ng、10ng，含铜0ng、50ng、100ng、200ng、500ng的系列浓度混合溶液。另精密量取汞标准品储备液适量，用10硝酸溶液稀释制成每1ml分别含汞0ng、0.2ng、0.5ng、ng、2ng、5ng的溶液，本液应临用配制。第三节 电感耦合等离子体质谱法（三）内标溶液的制备 精密量取锗、铟、铋单元素标准溶液

23、适量，用水稀释制成每1ml各含1g的混合溶液，即得。（四）供试品溶液的制备取供试品于60干燥2小时，粉碎成粗粉，取约0.5g，精密称定，置耐压耐高温微波消解罐中，加硝酸510ml（如果反应剧烈，放置至反应停止）。密闭并按各微波消解仪的相应要求及一定的消解程序进行消解。第三节 电感耦合等离子体质谱法消解完全后，冷却消解液低于60，取出消解罐，放凉，将消解液转入50ml量瓶中，用少量水洗涤消解罐3次，洗液合并于量瓶中，加入金单元素标准溶液（1gml）200l，用水稀释至刻度，摇匀，即得（如有少量沉淀，必要时可离心分取上清液）。除不加金单元素标准溶液外，其余同法制备试剂空白溶液。第三节 电感耦合等离子体质谱法（五）测定法测定时选取的同位素为63Cu、75As、114Cd、20