细胞转染Cell Transfection课件

1、细胞转染Cell Transfection陈亚玉 细胞转染随着分子生物学和细胞生物学研究的不断发展，转染已经成为研究和控制真核细胞基因功能的常规工具。在研究基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学试验中，其应用越来越广泛。转染(transfection)：真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程。 细胞转染瞬时转染(transienttransfection)外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说，超螺旋质粒DNA转染效率较高，在转染后24-72小时内（依赖

2、于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，半乳糖苷酶等来帮助检测稳定转染(stabletransfection)稳定转染，外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径物理介导：电穿孔法、显微注射、基因枪化学介导：.DEAE-葡聚

3、糖法、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、 多种阳离子物质介导 生物介导：原始的原生质体转染、病毒介导的转染 转染效率的因素影响 转染试剂 细胞状态 转染方法 载体构建 细胞培养物 细胞密度 血清 抗生素 氮磷比 DNA质量2 细胞状态一般低的细胞代数（50） 能确保基因型不变。 最适合转染的细胞是经过几次传代后达到指数生长期的细胞， 细胞生长旺盛， 最容易转染。 同一种系的细胞株， 在各实验室不同培养条件下， 其生物学性状发生不同程度的改变， 导致其转染特性也发生变化。 因此， 如果发现转染效率降低， 可以试着转染新鲜培养的细胞以恢复最佳结果。3 转染方法不同转染试剂有不同的转染方法， 但大多大

4、同小异。 应根据实验室的具体条件来确定最佳转染条件。（1） 细胞培养物健康的细胞培养物是成功转染的基础。 不同细胞有不同的培养基， 血清和添加物。 高的转染效率需要一定的细胞密度。 推荐在转染前 24 小时分细胞， 这将提供正常细胞代谢， 增加对外源 DNA 摄入的可能。 一定要避免细菌， 支原体或真菌的污染。（2） 细胞密度细胞密度对转染效率有一定的影响。 转染时过高或者过低的细胞密度会导致转染效率降低， 乃至表达水平偏低。 因此如果选用新的细胞系或者新的转染试剂，最好能够进行优化实验并为以后的实验建立一个稳定方法， 包括适当的接种量和培养时间等等， 总之是尽量在细胞最适的生理状态下转染，

5、以求最佳的转染效果。 （4） 抗生素细胞培养过程中往往会添加抗生素来防止污染， 但是这些添加剂可能对转染造成麻烦。 比如青霉素和链霉素， 就是影响转染的培养基添加物。 这些抗生素一般对于真核细胞无毒， 但有些转染试剂增加了细胞的通透性， 使抗生素可以进入细胞。 这可能间接导致细胞死亡， 造成转染效率低。 目 前转染试剂因为全程都可以用有血清和抗生素等添加剂的完全培养基来操作， 非常方便， 省去了污染等麻烦（5） 氮磷（N/P） 比N/P 比是转染效率的关键（为了换算方便， 一般以 DNA/转染试剂质量比表示） ， 在一定比例范围内转染效率随 N/P 比成比例增高， 之后达到平值， 但毒性也随之

6、而增加， 因此在实验之前应根据推荐比例， 确定本实验的最佳转染比例。4 载体构建转染载体的构建（病毒载体， 质粒 DNA， RNA， PCR 产物， 寡核苷酸等） 也影响转染结果。 病毒载体对特定宿主细胞感染效率较高， 但不同病毒载体有其特定的宿主， 有的还要求特定的细胞周期 。 除载体构建外， 载体的形态及大小对转染效率也有不同的影响， 如超螺旋及线性 DNA 对瞬时和稳定转染的影响。 如果基因产物对细胞有毒性作用， 转染也很难进行， 因此选择组成或可调控， 强度合适的启动子也很重要， 同时做空载体及其它基因的相同载体构建的转染正对照可排除毒性影响的干扰。细胞转染条件的材料真核表达质 粒 P

7、EGFP-N 带有表达绿色荧光蛋白 的 EGFP 基因，用 于细胞转染后衡量转基因的表达水平， 打靶载体（ Target Vector， 如图 2 所示） 在靶基因的同源序列之间插入新霉素抗性基因（ NEO）作为正筛选的标志， 在同源序列的 3端插有疱疹病毒胸苷激酶（ HSV-tk）基因作为负选择， 反复筛选后得到的细胞克隆数用 于衡量转基因的表达水平 . 细胞培养HeLa， HepG-2， NIH /3T3 细胞培养于含 10% 新生小牛血清的 DMEM 高糖培养液， 37 C ， 5% CO2， 90% 相对湿度培养箱中 . 在解冻小鼠 ES 细胞前， 先培养饲养层细胞 C57BL， 待长

8、满后， 用 含 10 ug /mL 的mitomycin C处理 2 2. 51h， 用 37 C 预热的 PBS 漂洗两次， 加普通培养液过夜培养 . 第二天， 解冻小鼠 ES 细胞， 在含 10% 胎牛血清7 . 175 X 109 pmoI /L LIF饲养层上培养 .细胞电穿孔法转染收获处于对数生长期的细胞， 用 冰预冷的 PBS 将细胞重悬为 4 X 106个 /mL， 细胞悬液中 加入 PEGFP-N3 至终浓度 10 ug /mL. 取 0. 5 mL DNA 与细胞混合液加到 4mm 电击池， 冰上放置 5 min （对照组室温放置）电击参数如下： 电容 950 uF,电阻 ,

9、电压 250 500 V 间 隔50 V 取值,以取得最佳转染率.电击后冰上放置 5 min（ 对照组室温放置）,向电击池中 加入 1 mL 预热的 培养液， 轻轻吸打， 将细胞转移到 已装有预热培养液的 皿中 ,摇匀,培养 24 h 后换新鲜培养液小鼠 ES 细胞， 用 冰预冷的 PBS 将处于对数生长期的细胞重悬为 1 X 107个 /mL， 取 0. 8 mL 细胞悬液与 25 ug 线性化的 Target Vector 混合， 加到 4 mm 电击池， 冰上放置 5 min (对照组室温放置）用 电压 240 V,电阻 ,电容 500 uF 和 950 uF 分别进行电穿孔转染， 电击

10、后冰上放置 5 mi n (对照组室温放置）将细胞转移到装有预热培养液的 15 mL 离心管中 ， 轻轻吸打均匀后， 将细胞悬液平均分到 6 个装有预热培养液（ 含 7 . 175 X109 pmoI /L LIF）铺好饲养层的 10 cm 培养皿中 ， 摇匀， 常规条件培养24 h后换新鲜培养液， 电击后 48 h,加250ug /mL G418 及 2 umoI /L gancycIovir 进行选择， 每天更换选择培养液 磷酸钙法转染在转染前一天将细胞分皿， 转染的当 天， 细胞应均匀 分布 . 细胞密度约 50% 70%,转染前 3 h换新鲜培养液（ 对照组培养液中 含 50 mmoI

11、 /L HEPES pH 7 . 2）所有转染试剂须预热至室温， 取 5ug DNA（ pEGFP-N3）用 0. 2 moI /L CaCI2稀释到 167 uL， 混匀后， 边轻轻震荡边滴加到 167 uL 2 X HBS 中,室温静置 15 20 min.将 DNA /磷酸钙复合物轻轻混匀， 滴加入 6 cm 培养皿的细胞中 ， 轻轻晃匀， 常规条件下培养 18h.吸去培养液， 用 3 mL 37 C 预热的 PBS 漂洗两次， 换新鲜培养液 转染率及死亡率的检测转染 PEGFP-N3 的 HeLa， HepG-2， NIH /3T3 细胞， 转染 24 1 后， 在 100 倍荧光显微镜下对表达绿色荧光蛋白 的细胞进行计数 . 转染了