白芷扩增片段长度多态性反应体系的建立及优化

1、白芷扩增片断长度多态性反响体系的创立及优化陈要臻郭丁丁马逾英，陈雯，王晓东，唐琳【摘要】目的创立白芷扩增片断长度多态性AFLP反响体系及挑选出扩增条带富厚的引物。要领以12份白芷为试材,对AFLP阐发历程中包罗提取DNA的要领、DNA的提取质量和浓度、se/ER酶切反响时间等举行了研究，从64对引物中挑选得当白芷的引物。结果改进的TAB要领提取的DNA质量比力好，创立了一种适于白芷AFLP银染技能的优化体系：模板DNA的用量为400ng,酶切体系中se和ER反响时间为4h，挑选出了7对得当白芷的引物。以引物E+AG/+AA构建的白芷种质资源的AFLP指纹图谱,扩增带多,多态性强。结论创立了实用

2、于白芷的AFLP反响体系，并挑选出了得当白芷的引物，为以后利用AFLP标识表记标帜技能举行白芷断定及种质遗传多样性阐发提供了尺度化步伐。【关键词】扩增片断长度多态性反响体系;白芷Keyrds：AFLPsyste;Angeliadahuruia扩增片断长度多态性aplifiedfragentlengthplyrphis,AFLP技能作为一项分子标识表记标帜技能，是1992年由荷兰Keygene公司科学家Zabeauare和Vspieter创造并生长起来的一种选择扩增限定性酶切片断的要领1。AFLP是基于RFLP(RestritinFragentLengthPlyrphis)和PR(Plyeras

3、ehainReatin)相结合的DNA阐发技能。这种要领是一种选择性扩增限定性片断的要领,它结合了RFLP和RAPD的长处,既具有前者的可靠性，又具有后者的便利性。现已被普及应用于生物多样性、指纹图谱构建、遗传图谱构建、基因克隆等诸多范畴2。白芷Angeliadahuria为伞形科植物，是一种常用中药，性温，味辛，具有散风除湿、通窍止痛、消肿排脓的成果。如今对白芷的研究重要会合在白芷的品格、化学身分、药理作用等方面，其种质资源多样性、亲缘干系等方面的研究也有一些报道3，4，但是运用AFLP技能对白芷基因组的研究还未见报道。因此本研究旨在创立一套得当于白芷的AFLP实行体系，并挑选出多态性强的引

4、物，为进一步研究白芷的遗传多样性、种间亲缘干系AFLP实行奠基基矗1质料与仪器1.1质料白芷，2022-04采自四川遂宁GAP基地白芷种质资源圃。质料原产地见表1。样品经成都中医药大门生药教研室马逾英传授断定。取奇怪叶片，用硅胶敏捷枯燥后带回实行室，储于-70冰箱保存。表1供试质料及泉源略1.2试剂ER，se，T4DNAligase，rTaq酶，dNTPs购自TaKaRa宝生物工程大连。seIERI讨论、seIERI焦点引物及seIERI选择性扩增引物由北京赛百盛基因技能合成。亲和硅烷、剥离硅烷等购于北京鼎国生物技能有限责任公司。甲叉双丙烯酰胺为瑞士入口分装。其他试剂均为国产阐发纯。1.3仪器

5、Bi-Rad(013208)PR扩增仪，GeneGeniusBi-iagingSyste凝胶成像仪，北京六一仪器厂消费的DYZ-20型垂直电泳体系。2要领2.1基因组DNA的提取与DNA质量检测接纳TAB和SDS法5,6，并举行改进。取3l总DNA举行1%的琼脂糖凝胶电泳，用GeneGeniusBi-iagingSyste凝胶成像阐发体系检测DNA质量。然后用UV-VISSpetrphteter(Tu-1901)型紫外分光光度仪别离测定其在260n，280n处的D值。纯的DNA溶液D260/D280应为1.8。D260/D280大于1.9时，表白有RNA污染，小于1.6时表白有卵白质或酚污染7

6、。及格的DNA浓度即是：D260样品稀释倍数50/1000。末了同一调解DNA浓度为100ngl-1。2.2白芷AFLP体系的创立AFLP实行流程按邹喻苹8等的要领举行，并参考别人在别的作物上的反响步伐9，10，15举行优化。表2AFLP选择性扩增引物序列略3结果3.1模板DNA的提取对AFLP而言，模板DNA的制备黑白常紧张的一个环节。模板DNA质量直接干系着实行的成败，由于模板的质量将影响酶切是否充实及以后的毗连反响。在实行中提取白芷DNA接纳了TAB和SDS两种要领，基因组DNA在1%琼脂糖凝胶上30in摆布，其结果如图1表现。SDS法提取的DNA点样孔十明白亮，说明含有较多的杂质，而T

7、AB所提DNA无落解，无RNA污染，样品匀称，条带清楚，分子量在2000bp摆布，且点样孔四周没有杂质。并且颠末测定，TAB提取的白芷DNA的D260/D280值在1.8摆布，SDS法提取的白芷DNA的D260/D280值在1.6摆布。说明经改进TAB法所提DNA纯度是很高的，可以用来举行白芷AFLP阐发。3.2模板DNA浓度酶切时方案了DNA的量100，200，300，400，500ng五个梯度，酶切结果如图2，可以看出AFLP对付DNA模板的浓度要求并不非常严酷，DNA100ng，200ng的酶切产物非常少，别的都得到了较为抱负的酶切片断。以是白芷AFLP阐发DNA模板用量以300500n

8、g为宜(反响体积50l)，太少其产物的量不敷，太多那么轻易导致酶切不充实。思量到经济的因素，本实行的DNA的量为400ng。3.3酶切时间对酶切反响的影响基因组DNA是否被完全酶切影响最闭幕果。假设DNA酶切不完全，酶切片断覆盖不了整个基因组，反响的不是真实的多态性10，11，难以创立真实的分子指纹图谱。酶切时间的黑白是影响模板DNA可否酶切充实和完全的一个紧张因素，差异种类的植物由于基因组巨细差异，酶切时间黑白也有差异。本实行用400ng的DNA样品,用se(10U)和ER酶(10U)，别离在37水浴中酶切方案了2，4，6h3个梯度，以及se、ER单独酶切2h。经1%琼脂糖凝胶电泳后的结果如

9、图3。2，4，6h样品号1，2，3都可将400ng的DNA完全酶切，到达AFLP阐发的要求。序号4为se酶切2h产物，序号5为ER酶切2h产物，作为比较，2h后ER，se都不克不及把400ng的DNA完全酶切，说明样品1、2、3都是双酶切的产物。随着时间的进一步延伸，酶切产物的分子量越来越小，浓度也越来越大。由此可见得当增长酶切时间，可进步酶切结果。但是时间过长,势必延伸整个实行周期。为了节流时间，确定酶切时间为4h。双酶切充实后，举行毗连，毗连电泳图如图4的15，可见毗连充实，可举行下一步实行。图1DNA琼脂糖凝胶电泳检测略3.4预扩增稀释倍数的影响预扩增引物只含1个选择性碱基，选择扩增性能

10、较差，需进一步举行选择性扩增。部门预扩增产物凝胶电泳图如图4的610。预扩增反响产物举行稀释后用作选择性扩增反响的模板，稀释5，10，15，20倍的预扩增产物都可以得到比力不变的选择性扩增条带。固然AFLP对DNA的浓度要求不严酷，但低于110-12gl-1时得到的AFLP指纹款式每每不成靠12。本实行确定预扩增产物的稀释为10倍。图2DNA双酶切检测略图3酶切琼脂糖凝胶电泳检测略图4毗连与预扩增产物琼脂糖凝胶电泳图略3.5选择性引物的挑选对一个个别的DNA，用64对引物举行扩增，挑选出25对扩增条带富厚，且多态性较好的引物。再用全部个别的混淆DNA，用这25对引物举行复筛，得到7对扩增条带富

11、厚、匀称、多态性好的引物见表3。表3挑选出的7对选择性扩增引物略3.6聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染聚丙烯酰胺凝胶的制作是个很关键的步调，起首玻璃板的洗涤必然要干净，其次剥离硅烷与亲和硅烷的涂抹必然要匀称，制止产气愤泡。隔夜胶易变干，跑出来的条带会弯曲。染色液与显影液都是现配现用。用E+AG/+AA选择性扩增后，6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳后，银染的结果如图5。可见条带清楚富厚，多态性性强。4讨论固然AFLP技能已被普及应用13，14，但由于AFLP实行流程较长、步调较多，涉及的因素也较多，实行中轻易出现一些题目。图512个白芷个别基因组E+AG/+AA引物组合选扩结果略在实行中必需严酷按实行流程操纵，

12、尤其留意以下几点：AFLP对DNA的质量要求很高，因此高纯度无污染的DNA是实行乐成的先决条件。本实行对SDS法和TAB法举行了比力，创造SDS法提取的DNA纯度太低，并且DNA样品中0.01%的SDS会使ER的活性丧失80%以上15，因此本实行接纳了改进的TAB法。对付模板DNA的浓度,大多数研究以为AFLP阐发对DNA的浓度并不敏感12，但从我们的研究中创造，照旧应留意酶切时DNA量不克不及太多，量太多，酶切难以充实，易造成拖带征象，带型模糊，难以区分；太少时，显带很弱或显不出带来。一样平常DNA模板用量以300500ng为宜。把握好酶切时间。AFLP是对酶切DNA片断举行选择扩增，以是基因组DNA的充实酶切非常紧张，在利用限定性内切酶水解基因组时，必然要彻底。DNA的酶切完全与否直接影响AFLP的指纹图谱的质量，