实验三微生物检定法测定硫酸庆大霉素的效价

1、(整理)实验三微生物检定法测定硫酸庆大霉素的效价.(整理)实验三微生物检定法测定硫酸庆大霉素的效价.11/11(整理)实验三微生物检定法测定硫酸庆大霉素的效价.优选文档实验三微生物检定法测定硫酸庆大霉素的效价一、归纳由于抗生素多为结构复杂的多组分物质，异构体多，且不牢固，简单产生降解杂质，故各国药典均以微生物检定法为主要含量测定法，由于抗生素药品的医疗作用主若是它的抗菌活力，而微生物检定法正是以抗生素的抗菌活力为指标来衡量抗生素效价的一种方法，其测定原理与临床要求相一致，能直接反响抗生素医疗价值，因此素来为各国药典所采用的主要测定方法。微生物检定法测定抗生素效价，一般可分为稀释法、比浊法和琼脂

2、扩散法三类。以琼脂扩散法应用最广泛，为目前国际上测定抗生素效价的通用方法。琼脂扩散法，亦称管碟法。系采用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，采用量反响平行线原理的设计，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。二、基本设备、用具和试验资料基本设备抗生素效价测定实验室：室内应为半无菌，装有紫外线灯，有固定的效价测定台，台面要求水平、防震。该室应与稀释抗生素溶液的工作室间隔，以防范空气、地面污染抗生素。超净工作台：超净工作台应放置在洁净工作室或半无菌室内。抑菌圈面积测量剖析仪：该仪器装有微办理机，可自动测量抑菌圈面积，并打印出统计剖析的各种数据。2.用具（1）玻

3、璃双碟：为硬质玻璃制品，碟底内径约90mm，碟高16-17mm，碟底面应平，厚薄平均无凹凸现象。新购的双碟应按上述要求进行检查。检查时可将双碟底平放在水平台上，每碟内加入2ml染料液，仔细观察碟底反响的颜色深浅可否一优选文档优选文档致，优选底部平的双碟，洗净晾干，置高温烘箱内140-160干热灭菌2小时后备用。陶瓦圆盖：应平，无凹凸现象。不锈钢小管：外径7.80.1mm，内径6.00.1mm，高10.00.1mm，重量差别不高出25mg，钢管内外壁要求光洁，管壁厚薄要一致，两端面要平坦光洁。小钢管放置器：四孔，一台。游标卡尺：精良度0.02mm。滴管：管口应修长圆滑，不得出缺口。试验资料(1)

4、培养基I：取胨5g、牛肉浸出粉3g、磷酸氢二钾3g和蒸馏水1000ml，加热融化，混杂，调治pH使其值比最后的pH值略高，加入琼脂20g，加热溶化过后，调治pH值使灭菌后为，在115灭菌30分钟。(2)营养琼脂培养基：取胨10g、氯化钠5g和肉浸液1000ml，混杂，调治pH使比最后的pH值略高，加入琼脂15-20g，加热溶化过后，调治pH值使灭菌后为，分装，在115灭菌30分钟，趁热斜放使凝固成斜面。(3)磷酸盐缓冲液（pH7.8）：取磷酸氢二钾5.59g与磷酸二氢钾0.41g，加蒸馏水使成1000ml，在115灭菌30分钟。(4)试验用菌种：短小芽孢杆菌(CMCC(B)63202).短小芽

5、孢杆菌菌悬液的制备和保存：取短小芽孢杆菌试验用菌种斜面1支，按无菌操作要求加入灭菌水2ml，将菌苔洗下，摇匀，取出1ml接种于盛有30ml营养琼脂培养基的100ml三角瓶中，在35-37培养7日，用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85%以上，用灭菌水20ml将芽孢洗下，制成悬液，在65水浴中加热30分钟，即得，置5冰箱中保存，可使用6个月。双碟的制备：取直径约90mm、高16-17mm的平底双碟，分别注入加热融化的培养基I20ml,使在碟底内平均派布，放置水平台上使凝固，作为基层。另取培优选文档优选文档养基合适加热融化后，放冷至50-60，加入菌悬液合适（能得清楚的抑菌圈为度）,摇匀，在每1双碟

6、中分别加入5ml，使在基层上平均派布，作为菌层。放置水平台上冷却后，在每1双碟中以等距离平均部署不锈钢小管（内径6.00.1mm，高10.00.1mm，外径7.80.1mm）4个，用陶瓦圆盖覆盖备用。三、二剂量检定法取照上述方法制备的双碟不得少于4个，在每1双碟中对角的2个不锈钢小管中分别滴装高浓度及低浓度的标准品溶液，其余2个小管中分别滴装相应的高低两种浓度的供试品溶液；高、低浓度的剂距为2：1或4：1。在35-37条件下培养14-16小时后，测量各个抑菌圈的直径（或面积），照生物检定统计法中的(2.2)法进行可靠性测试及效价计算。四、硫酸庆大霉素的效价测定：标准品溶液的配制：精良称取硫酸庆

7、大霉素标准品合适，加乙醇溶解后，用灭菌水制成每1ml中含1000单位的溶液，作为贮备液，置5以下的冰箱中保存，可使用7日。将贮备液加pH7.8磷酸盐缓冲液稀释，使标准品高剂量溶液和低剂量溶液每ml中分别含硫酸庆大霉素10U和5U。2.供试品溶液的配制：取硫酸庆大霉素肠溶片4片，研细，用乙醇合适（硫酸庆大霉素约0.25g，用乙醇25ml），分次研磨使硫酸庆大霉素溶解，并用水稀释成每1ml中约含1000单位的溶液，摇匀，静置，精良量取上清液合适，按（1）法同法配制，使供试品高剂量溶液和低剂量溶液按标示量计算每ml中含硫酸庆大霉素分别为10U和5U。测定法：按二剂量检定法测定效价，计算出供试品中含硫

8、酸庆大霉素相当于标示量的百分数。附录：生物检定统计法中的（2.2）法抗生素微生物检定法是以微生物为工具，不能够防范地存在着较大的生物差别性，优选文档优选文档因此，必定借助于生物统计方法来减少生物差别对检定结果的影响，使结果达到必定的精确度。英、美、日等国家药典附录中都详细地拟订了生物检定方法的实验设计和统计剖析，并依照生物统计的要求规定了各个品种的误差范围。中国药典从1985年版起增加了生物检定法的实验设计和可靠性测试及误差估计等内容，这对判断检验质量及促使检验方法的改进等方面都拥有重要意义。可靠性测试抗生素微生物检定法依照观察的方法和生物反响的种类属量反响，即观察每一反响自己所表现的程度，能

9、够用量来表示。实验设计采用供试品（T）和已知效价的标准品（S）比较试验的平行线原理。由于平行线测定的计算原理是在必定剂量范围内T和S的对数剂量与反响或反响的特定函数呈直线关系以及在T和S两条直线互相平行（当T和S的活性组分基真相同时）的基础上，因此，可靠性测试就是运用统计方法来考据明验结果可否切合量反响的平行线设计原理，可否明显偏离了直线性和平行性，以便讨论实验结果的可靠性。对不是明显偏离平行偏离直线（在必定的概率水平下）的实验结果，认为可靠性成立，方可按有关公式计算供试品的效价和可信限。可靠性测试的统计方法抗生素微生物检定法的可靠性测试采用F测试，即实验结果的方差剖析。方差剖析为测试多组均数

10、之间的差别可否明显。经过统计运算求得试品间、回归、偏离平行、剂间及碟间项的方差，并以统计得的以上各项方差和误差项方差（S2）各该项方差的比值称F值（各项F值=）作为指标来观察其差其余明显性误差项方差（S)程度。将实验结果求得的F值，按相应各项的自由度及误差项的自由度查F值表来判断实验结果求得的F值是大于还是小于F值表上Ff1f20.05和Ff1f20.01的F值。优选文档优选文档若大于Ff1f20.05的F值，则P0.05,表示差别有明显意义。若大于Ff1f20.01的F值，则P0.05,表示差别无明显意义。P称概率，即某一事件在必定条件下可能发生的时机，P就是时机的定量表现形式，用数量的形式

11、来反响出事情必定性的规律，它是生物统计的基础，一般在统计中评定实验结果的可靠程度以P表示，P=0.05，即表示可靠性有95%的掌握，P=0.01，即表示可靠性有99%的掌握。可靠性测试一般分为下述两个步骤：实验结果的方差剖析：从实验数据的总变异差方和中分出剂间变异和碟间变异的差方和后，即为误差项的差方和，其方差以S2表示。第一按剂量组将各反响值y（抑菌圈的直径）列成方阵见表1。表1实验结果双碟数剂量组总和总和平方(1)(2)(3)（K）ymym21y1(1)y1(2)y1(3)y1(k)y1y122y2(1)y2(2)y2(3)y2(k)y222y3y3(1)y3(2)y3(3)y3(k)y3

12、32ymym(1)ym(2)ym(3)ym(k)ym2my总和y(1)y(2)y(3)y(k)y总和y(k)ym2总和平方y(1)2y(2)2y(3)2y(k)2总和y2的总和y(k)2y(k)2y2优选文档优选文档表1中，K为S和T的剂量组数，m为各组内y的个数（即双碟数），各组的m应相等，n为反响的总个数，n=mk。各项变异的差方和及自由度（f）的计算2差方和（总）=y2(y)nf(总)=n1式中(y)2=校正数ny(k)2差方和（剂间）=m校正数f(剂间)=K1y(m)2差方和（碟间）=校正数kf(碟间)=m1差方和（误差）=差方和（总）差方和（剂间）差方和（碟间）f(误差)=f(总)f

13、(剂间)f(碟间)=（k1）（m1）该项差方和方差=该项自由度差方和误差S2=f误差2Kmy2Ky(k)2mym2y2或S=Km(K1)(m1)剂间变异的剖析：剂间变异的明显性测试主要包括S和T试品间、回归、平优选文档优选文档行性及直线性等变异内容。各项变异的差方和及自由度（f）按表2二剂量法和表3三剂量法可靠性测试正交多项系数表计算。表2二剂量法可靠性测试正交多项系数表y(k)变异本源S2差方和自由度S1T1T2正交多项系数（Ci）-111Ciy(k)2m21Ci-1试品间Ciy(k)回归-11-11mCi21-1-1Ciy(k)1mCi2偏离平行表中正交多项系数用Ci表示，y（k）为各剂量

14、组反响值之和。2121各项变异的差方和=Ciy(k)2，除以该项的自由度即等于方差。以各变mCi2异项的方差与误差项的方差（S2）的比值作为指标，进行F测试，以判断各项变异本源差别可否有明显意义。（2）可靠性测试结果剖析试品间：考据标准品（S）和供试品（T）的结果可否有差别，如P0.05，即表示差别无明显意义。回归：考据S和T两条对数剂量反响直线可否偏离直线性，因实验设计采用的剂量间距是等比级数，故反响应随剂量的增加而有规律的增加，若各反响点平均的分布在一条直线上，就表示实验的直线性好，当该项统计得的P0.05，即证明偏离平行不明显，从而说明S和T两条直线互相平行。剂间：二剂量法和三剂量法，各

15、有二个剂量和三个剂量，不一样样剂量所致的反响应有明显的差别，如无差别则说明剂量反响不在直线范围内，应重新调整剂量进行实验，使该项统计得的P0.05时，则表示无明显差别。但在一般情况下，双碟之间的差别总是存在的，故在统计公式中已合适的分除碟间差别。综上所述，实验最可靠的结论归纳以下：试品间差别不明显，P0.05。回归明显，0.05。二次曲线与反向二次曲线均不明显，0.05。剂间差别明显，0.05。.效价计算测得供试品的效价单位数（U/mg或ml）；优选文档优选文档供试品的标示量效价或估计效价；测得的供试品（）的效价相当于的百分率。log-1MVIM=W：高、低剂量比值的对数二剂量法：dS2标准品

16、高剂量dT2供试品高剂量1（）21（）2本法计算所得效价，如低于估计效价的或高于估计效价的时，则应调整其估计效价，重新进行测定。.可信限计算由于生物差别性的存在，生物检定的实验误差一般都比较大，故实验结果可是对于真实结果的一个估计值，它对真实结果还有一段距离，可信限（L）就是对真正结果的一个估计范围。因此，可信限是精良度的一个标志，常用来表示实验误差，一般以概率水平0.95时实验结果的可信限高限和低限的范围来表示，即“实质结果可信限”，在生物检定中，每个品种，依照所规定的检验方法，都可总结出一个正常的可信限率（如英国药典规定抗生素生物检定法的可信限率不得大于。中国药典年版也规定可信限率不得大于），若高出这个限率，说明实验结是可疑应重新进行实验。的可信限log-1(MSM)的可信限低限l