病毒的形态学诊断

1、PAGE PAGE 32Evaluation Warning: The document was created with Spire.Doc for .NET.实验十 病毒的形态学诊断、培养方法和血清学试验目 的（一）观察察病毒包包涵体，并并掌握其其诊断意意义。（二）掌握握病毒的的形态并并了解病病毒包膜膜的获得得。（三）了解解病毒培培养的三三种方法法。（四）掌握握病毒学学中主要要血清学学反应的的原理（五）熟悉悉病毒血血凝抑制制试验的的测定过过程内 容（一）病毒毒的形态态学诊断断1. 病毒毒的电镜镜照片（示示教）2. 狂犬犬病毒包包涵体（示示教）3. 麻疹疹病毒包包涵体（示示教）（二）病毒毒的

2、培养养法（录录像） 1. 病毒毒的动物物接种法法 2. 病毒毒鸡胚培培养法 3. 病毒毒的组织织培养法法 （三）血凝抑制试验（操作）病毒的形态态学诊断断病毒形态态学研究究方法可可分为两两种：一一种是应应用电子子显微镜镜技术，观观察其大大小，形形态及排排列特征征，以帮帮助诊断断；另一一种是应应用光学学显微镜镜通过涂涂片染色色或切片片染色，观观察包涵涵体。病病毒感染染细胞所所产生的的包涵体体，其特特征基本本是固定定的，故故对病毒毒性疾病病的诊断断具有一一定价值值。【方法】（一）病毒毒的电镜镜照片（示示教）观察腺病病毒、疱疱疹病毒毒的电镜镜照片，注注意其形形态结构构、大小小、排列列、及其其包膜的的形

3、成。（二）狂狂犬病病病毒内基基（Neegrii）包涵涵体（示示教）用高倍镜镜或油镜镜观察经经HE（苏苏木紫-伊红染染色）染染色的死死于狂犬犬病的犬犬脑组织织切片，注注意包涵涵体在细细胞内的的形态、位位置及染染色性。（三）麻麻疹病毒毒包涵体体（示教教）用高倍镜镜或油镜镜观察经经麻疹病病毒培养养后，HHE染色色的人胚胚或羊膜膜细胞标标本片，注注意包涵涵体在细细胞内的的位置、形形态、染染色性以以及细胞胞融合情情况。病毒动物接接种法实验动物物在病毒毒学研究究中有四四方面用用途：分离鉴鉴定病毒毒，如乙乙脑病毒毒；连续传传代通过过，以减减弱有毒毒株对人人的致病病力，如如狂犬病病病毒；制备抗抗血清；病毒致致

4、病机理理的研究究。常用的实实验动物物有小白白鼠、地地鼠、豚豚鼠、家家兔、绵绵羊、鸡鸡、猴等等。在病病毒学研研究中，动动物接种种时为避避免动物物本身可可能带有有病毒，多多采用实实验室自自己繁殖殖的动物物。首先先根据研研究目的的选择动动物种类类，对病病毒致病病机制的的研究，则则选择愈愈接近人人类的高高等动物物（例如如灵长类类）研究究结果愈愈有价值值；其次次要注意意动物的的年龄、性性别和接接种的途途径等各各种因素素，一般般年幼的的动物比比成年动动物对病病毒的敏敏感性高高。至于于接种的的途径应应根据病病毒的嗜嗜性决定定，例如如脑炎病病毒以脑脑内注射射最敏感感。（一）小小白鼠尾尾静脉接接种（录录像）【材

5、料】1. 动动物：小小白鼠2. 病病毒悬液液3. 碘碘酒、酒酒精、二二甲苯、无无菌0.25mml注射射器、44号针头头及小铝铝匣【方法】1. 将将小白鼠鼠固定在在小铝匣匣内，露露出尾部部，用碘碘酒消毒毒尾部，然然后用酒酒精棉球球连续擦擦尾部皮皮肤（必必要时用用二甲苯苯擦）使使血管扩扩张。2. 尾尾背和左左右两侧侧三根血血管皆为为静脉，可可选一根根扩张较较好的静静脉作接接种用。左左手拇指指捏住尾尾部的远远端，向向下弯445，右手手持注射射器，于于弯处进进针静脉脉，推液液0.11毫升。注意：推推注时遇遇阻力且且皮下隆隆起发白白时，表表示针头头不在血血管内应应拔出重重新进针针；如针针头在血血管内，推

6、推注时不不感阻力力，且可可看到血血管中血血液由于于注入液液体而后后退。接种后逐逐日观察察动物发发病情况况。（二）小白白鼠鼻内内接种（录录像）【材料】小白鼠、流流感病毒毒鼠肺适适应株病病毒悬液液、无菌菌小试管管、无菌菌毛细管管、麻醉醉用乙醚醚、棉球球及小玻玻瓶。【方法】1. 首首先将沾沾有乙醚醚的棉球球放入一一清洁小小玻瓶内内。左手手握小瓶瓶，右手手抓住小小白鼠，将将其头部部塞入瓶瓶口，进进行全身身麻醉。注注意麻醉醉深度，不不宜太浅浅或太深深，太深深时易遭遭致麻醉醉死亡或或非特异异性吸入入性肺炎炎，太浅浅则易在在滴种时时打喷嚏嚏。2. 用用无菌毛毛细吸管管吸取病病毒悬液液少许，连连同毛细细吸管插

7、插在无菌菌试管中中备用。3. 用用左手将将小白鼠鼠握在手手掌中，大大拇指及及食指抓抓住小白白鼠耳部部使其头头部朝前前并呈仰仰卧位置置，另一一手取事事先吸有有病毒悬悬液的吸吸管，慢慢慢滴出出一点于于滴管口口而不使使其自然然掉落，呈呈悬滴状状。将悬悬滴靠近近动物鼻鼻尖，动动物在呼呼吸时自自然吸入入，一般般为0.030.005毫升升，不宜宜过多。4. 小小白鼠慢慢慢苏醒醒，在饲饲养盒中中逐日开开始发病病，发病病的症状状常为毛毛耸、咳咳嗽、不不食、甚甚至死亡亡。解剖剖尸体可可观察到到肺炎或或血性病病灶。（三）小小白鼠脑脑内接种种（录像像）【材料】脑炎病毒（小小白鼠脑脑脊髓炎炎病毒）悬悬液。脑脑组织先先

8、用无菌菌生理盐盐水洗去去血液，再再加100脱脂脂奶盐水水研磨成成101悬液液，然后后用30000转转/分离离心沉淀淀30分分钟，吸吸取上清清液供接接种用。小白鼠：33周龄，体体重68克。无菌0.225毫升升注射器器及针头头（4号号）、煮煮针锅、碘碘酊、棉棉签。【方法】1. 以以无菌00.255毫升注注射器抽抽取脑炎炎病毒悬悬液0.1毫升升，去除除注射器器内的气气泡。2. 取取出小白白鼠，左左手将小小白鼠固固定，固固定时用用大拇指指和食指指捏住小小白鼠的的头部，左左手手掌掌轻轻按按住小白白鼠的体体部。3. 右右手以棉棉签蘸以以碘酒，消消毒小白白鼠颞部部皮毛（不不碰到眼眼）。4. 右右手拿注注射器

9、在在小白鼠鼠颞部（眼眼与耳根根连线的的中点略略偏耳朵朵的方向向）刺入入，进入入颅腔，进进针23毫米米，不要要插得太太深，注注射量为为0.00200.033毫升。5. 注注射完毕毕，将用用过得注注射器放放入煮针针锅内煮煮沸消毒毒。动物物一般在在344天后开开始发病病，食欲欲减退，活活动迟钝钝，毛耸耸，震颤颤，慢慢慢发展为为麻痹，瘫瘫痪而死死亡。本法适用用于一些些脑炎病病毒的分分离培养养。病毒鸡胚培培养法鸡胚培养养法常用用于痘类类病毒、粘粘病毒和和疱疹病病毒的分分离、鉴鉴定、制制备抗原原、生产产疫苗以以及研究究病毒性性质等。鸡胚和实实验动物物一样，为为一整体体动物，有有神经血血管的分分布及脏脏器的

10、构构造；鸡鸡胚的组组织分化化程度低低，病毒毒易于繁繁殖，感感染了病病毒的膜膜结构和和液体中中，含有有大量病病毒；鸡鸡胚来源源充足，操操作简单单、通常常本身是是无菌的的，对接接种的病病毒不产产生抗体体为其优优点，但但除产生生痘疱的的病毒及及引起鸡鸡胚死亡亡的病毒毒外，通通常不产产生特异异性的感感染指征征，必须须利用第第二个试试验系统统来测定定病毒的的增殖。常用的鸡鸡胚接种种方法有有四种，即即绒毛尿尿囊膜上上接种法法、羊膜膜腔接种种法、尿尿囊接种种法及卵卵黄囊接接种法。根根据不同同病毒和和不同目目的采用用合适的的接种方方法。（一）尿囊囊腔接种种法（录录像）【材料】副流感病病毒1003稀释释液，11

11、0112日龄龄鸡胚、无无菌1毫毫升注射射器及77号针头头、电动动磨蛋器器、检蛋蛋灯、弯弯头小镊镊子、蛋蛋架、碘碘酒棉球球、胶布布、大头头针、无无菌试管管、无菌菌毛细吸吸管。【方法】1. 选选用100122日龄鸡鸡胚，在在照蛋灯灯上照视视观察鸡鸡胚是否否存活，根根据如下下：小血管管是否清清晰；胚胎是是否活动动，观察察小鸡的的眼睛黑黑点是否否移动；蛋白一一边和胎胎盘一边边是否界界限分明明，蛋白白一边较较亮，胎胎盘一边边暗红色色，如果果胎盘一一边发黑黑或苍白白都表示示胚蛋已已死亡。用铅笔标标明天然然气室，鸡鸡胚及大大血管位位置，然然后在绒绒毛尿囊囊膜发育育区避开开大血管管的地方方作一记记号，定定为注

12、射射入口。绒绒毛尿囊囊膜区血血管丰富富，在照照视时呈呈现红色色，几乎乎占据鸡鸡蛋的二二分之一一。2. 用用碘酒消消毒注射射入口和和天然气气室端的的蛋壳，再再用电动动磨蛋器器于注射射入口和和天然气气室端的的蛋壳上上磨一小小孔，勿勿伤及卵卵膜。3用大大头针通通过火焰焰消毒后后刺穿气气室端所所开小孔孔的卵膜膜，这样样可避免免在注射射时液体体回流出出来。4将鸡鸡胚横卧卧于蛋架架上，用用无菌11毫升注注射器抽抽取病毒毒液体，针针头于卵卵壳成330交角，由由注射小小孔刺入入0.551.0厘米米，注射射0.110.2毫升升（图110-11）。5注射射完结用用胶布封封口。封封口前胶胶布用碘碘酒消毒毒，并通通过

13、火焰焰烧去余余碘。用用过的注注射器用用煮沸法法消毒，鸡鸡胚放入入3537培养。6注射射后次日日，逐日日观察鸡鸡胚生活活情况，孵孵育488722小时后后移入44冰箱。注注意鸡胚胚必须直直立，令令气室端端朝上。7收获获尿囊液液之前取取出鸡胚胚，用碘碘酒消毒毒气室端端，并用用镊子击击破气室室端卵壳壳，沿气气室边缘缘小心打打开一大大缺口，然然后用小小镊子撕撕去卵膜膜及撕破破绒毛尿尿囊膜，最最后用毛毛细管吸吸取尿囊囊液，一一般可吸吸得45毫升升。8滴定定尿囊液液的病毒毒血凝效效价。尿囊接种法法适用于于某些呼呼吸道病病毒，如如流感病病毒、副副流感病病毒、新新城鸡瘟瘟病毒等等的培养养，惟分分离培养养不如羊羊

14、膜腔接接种法阳阳性率高高。羊水卵白羊水卵白气室气室卵黄囊尿囊液卵黄囊尿囊液图 10-1 鸡胚尿囊腔接种法图 10-1 鸡胚尿囊腔接种法（二）绒毛毛尿囊膜膜上接种种法（录录像）【材料】牛痘苗病毒毒103稀释释液、110113日龄龄鸡胚、橡橡皮乳头头、眼科科镊子或或小剪刀刀、无菌菌培养皿皿、无菌菌生理盐盐水，其其余同尿尿囊腔接接种法。【方法】1选用110113日龄龄鸡胚，在在照蛋灯灯上照视视观察是是否活胚胚蛋，用用铅笔划划下绒毛毛尿囊膜膜发育的的界限。2将胚蛋蛋横卧于于蛋座上上，使其其绒毛尿尿囊膜部部位朝上上，用碘碘酒消毒毒绒毛尿尿囊膜部部位和天天然气室室端的中中心部，待待干后即即用磨蛋蛋器轻轻轻

15、在绒毛毛尿囊膜膜中心部部磨一三三角形窗窗口（每每边一厘厘米许），磨磨破卵壳壳而不使使卵膜破破裂，同同时用磨磨蛋器于于气室端端开一小小孔。注注意：已已磨好之之鸡胚必必须于112小小时内接接种，否否则绒毛毛尿囊膜膜易与卵卵壳粘着着。3用分离离针或大大头针通通过火焰焰消毒，穿穿通天然然气室端端所锯小小孔；并并用分离离针或大大头针轻轻轻划破破卵壳，露露出三角角形卵膜膜，最好好将分离离针或大大头针330角度自自上往下下压迫卵卵膜一个个小口，这这样不致致损伤绒绒毛尿囊囊膜。4立即用用橡皮乳乳头在天天然气室室一端小小孔吸气气233次，目目的将天天然气室室的空气气吸去，而而上面所所开的洞洞口进入入空气，形形成

16、一个个人工气气室，可可在照蛋蛋灯上照照视一下下，看天天然气室室是否消消失，如如未消失失则尚需需再吸气气数次（图图10-2）。5用小镊镊子通过过火焰灭灭菌，稍稍待冷却却后将三三角形窗窗口的卵卵膜撕去去、暂时时盖以无无菌培养养皿防止止污染，然然后用消消毒注射射器吸取取牛痘苗苗悬液（11033稀释液液，内加加适量的的链霉素素及青霉霉素），揭揭去培养养皿，于于窗口滴滴入0.100.2毫毫升病毒毒液，注注毕后窗窗口用胶胶布封口口，封口口前胶布布用碘酒酒消毒，并并通过火火焰，烧烧去余碘碘。用过过的注射射器煮沸沸消毒。6孵育于于37温箱，每每日观察察生活情情况，接接种1003稀释释的牛痘痘苗后的的鸡胚一一般

17、不死死亡，但但也可能能在3天天之后发发生死亡亡，如发发现死亡亡则立即即放入普普通冰箱箱，如不不死亡则则培养445日日后放入入普通冰冰箱，等等待观察察检查。7将感染染病毒的的鸡胚自自冰箱中中取出，用用碘酒消消毒人工工气室面面，然后后用镊子子撕去胶胶布并将将卵壳的的三角形形窗口扩扩大，以以便剪取取绒毛膜膜，此时时在明亮亮处可清清楚地看看到牛痘痘斑，呈呈白色点点状，有有时融合合成一堆堆或一片片。8左手用用小镊子子镊起绒绒毛尿囊囊膜，右右手用小小剪顺卵卵壳四周周剪下绒绒毛尿囊囊膜放入入无菌培培养皿内内，并用用无菌生生理盐水水洗涤112次次，再将将膜张开开，膜上上牛痘斑斑就看得得更为清清楚。绒毛尿囊膜膜

18、上接种种法，除除适用于于天花，牛牛痘等病病毒外，尚尚适用于于单纯疱疱疹病毒毒和其它它一些病病毒，但但其它一一些病毒毒不如天天花、牛牛痘、单单疱疹病病毒那样样具有明明显的病病斑。绒毛尿囊膜绒毛尿囊膜羊水羊水卵白卵白卵黄囊卵黄囊尿囊液尿囊液图10-2 鸡胚绒毛尿囊膜上接种图10-2 鸡胚绒毛尿囊膜上接种（三）羊膜膜腔接种种法（录录像）【材料】副流感病毒毒103稀释释液、99100日龄鸡鸡胚、灭灭菌液体体石蜡、其其余同尿尿囊腔接接种法。【方法】1所用鸡鸡胚在使使用前一一天，将将鸡胚直直立卵盘盘培养，使使其胚胎胎向上，便便于操作作。 22接种种前检查查鸡胚生生活情况况，并用用铅笔画画出天然然气室和和胚

19、胎的的位置，然然后用磨磨蛋器沿沿天然气气室的边边缘和胚胚胎位置置近处，锯锯一方形形小窗（每每边约11厘米许许，如图图10-3）。3用小小镊子挑挑去方形形卵壳和和撕去卵卵膜，再再用无菌菌吸管，吸吸取石蜡蜡油少许许，滴入入2滴，石石蜡油在在气室面面的卵膜膜上很快快散开，使使膜透明明，这样样在鸡蛋蛋照明灯灯或检蛋蛋灯上，可可清楚地地观察到到整个鸡鸡胚。4用无无菌1毫毫升注射射器抽取取少许流流感病毒毒液体，将将鸡蛋直直立于照照明灯或或检蛋灯灯上，针针头自窗窗口对着着鸡胚直直下，穿穿过绒毛毛尿囊膜膜，羊膜膜腔、推推动注射射器，注注入0.100.2毫毫升，针针头刺入入时注意意勿伤及及鸡胚本本身，最最好从小

20、小鸡的颈颈部空隙隙中插入入。5注射射完毕后后，用胶胶布封口口（胶布布先经碘碘酒消毒毒和通过过火焰烧烧去余碘碘处理）。用用过的注注射器煮煮沸消毒毒处理。鸡鸡胚放入入3537培养448772小时时。6自注注射后次次日起逐逐日检查查鸡胚的的生活情情况，22日以内内死亡者者多为非非特异性性损伤而而致死；2日后后死亡者者视为特特异性死死亡，流流感或副副流感病病毒1003稀释释注射时时，一般般不引起起死亡。收收获病毒毒之前将将鸡胚移移入普通通冰箱118224小时时，将鸡鸡胚冻死死，以减减少收获获时的出出血。7冰箱箱取出鸡鸡胚，碘碘酒消毒毒鸡蛋气气室端，撕撕去胶布布并将蛋蛋壳窗口口扩大，用用小镊子子撕破卵卵

21、膜及绒绒毛尿囊囊膜，然然后用毛毛细管吸吸出尿囊囊液弃去去，尿囊囊液吸完完后，左左手持镊镊子镊住住羊膜腔腔，右手手以毛细细吸管插插入羊膜膜腔吸取取羊水，一一般羊水水可吸出出一毫升升左右。8滴定定羊水的的病毒血血凝效价价。羊膜腔接接种方法法适用于于一些呼呼吸道病病毒，如如流感病病毒、副副流感病病毒及流流行性腮腮腺炎病病毒等的的分离。 卵黄囊卵黄囊气室卵白气室卵白羊水羊水尿囊液尿囊液图 10-3图 10-3羊膜腔接种法四、病毒细细胞培养养法及病病变观察察（录像像）细胞培养法法是目前前培养病病毒应用用最广的的一种培培养方法法，其优优点是（11）经济济适用，结结果正确确且敏感感；（22）较实实验动物物易

22、于控控制。细细胞培养养法多应应用于病病毒的分分离培养养，进行行血清中中和试验验及制造造疫苗和和抗原等等方面。很多组织细细胞，包包括鸡胚胚、鼠胚胚、各种种动物的的肾组织织细胞，人人胚羊膜膜组织细细胞或流流产胎儿儿组织细细胞（应应在死后后6小时时内采取取，因时时间过长长，组织织细胞生生长成功功率下降降）等均均可作细细胞培养养的来源源。细胞的选择择主要依依据组织织细胞对对病毒的的敏感性性。能引引起病变变的组织织细胞，往往往取自自病毒的的自然宿宿主，特特别是引引起疾病病的宿主主的某些些脏器组组织细胞胞。人类类病毒，用用人或猴猴的组织织细胞较较敏感，但但这不是是绝对的的，如地地鼠肾细细胞较人人肾细胞胞对

23、流行行性乙型型脑炎病病毒敏感感。原代细胞培培养法【材料】910日日龄鸡胚胚、Haankss氏溶液液、0.25胰酶溶溶液、无无菌小剪剪、镊子子、无菌菌培养皿皿、毛细细吸管、吸吸管、沉沉淀管、无无菌细胞胞培养管管（抗生生素空瓶瓶）、1100毫毫升无菌菌玻璃瓶瓶或三角角烧瓶、备备有四层层纱布的的玻璃漏漏斗。【方法】1用碘酒酒消毒鸡鸡胚蛋气气室外壳壳，并将将它直立立于蛋架架上，以以镊子将将鸡胚取取出放入入无菌培培养皿内内，去头头爪及内内脏。2用小剪剪在培养养皿内将将胚胎剪剪成小块块（45毫米米3），加加Hannks氏氏溶液（约约10毫毫升）冲冲洗，静静置12分钟钟后，用用毛细吸吸管吸取取液体。依依同法

24、再再洗涤22次，将将血球充充分洗去去。3用镊子子将组织织块放入入无菌玻玻璃瓶或或三角烧烧瓶内，加加入100155毫升00.255胰酶酶溶液，37水浴20分钟，中间摇动几次。由于胰酶的作用可使大量细胞游离，液体变混。经四层纱布过滤后的细胞悬液，低速离心沉淀（1000转/分以内）5分钟，吸取上清液，沉淀物加入适量营养液，用白细胞计数的方法进行计数，使成每毫升含5080万细胞悬液以作单层细胞培养。4每一细细胞培养养管，注注入细胞胞悬液11毫升，盖盖好瓶塞塞，并将将瓶略加加摇动，横横卧于有有槽木架架上，使使细胞均均匀平铺铺于管壁壁。置337温箱孵孵育，一一般4小小时，细细胞附着着于管壁壁，488小时可

25、可长成单单层，此此时即可可调换营营养液，接接种病毒毒。传代细胞培培养法从人及动物物组织，特特别是肿肿瘤组织织，经过过多次传传代可建建立传代代细胞系系。这种种细胞能能无限地地传代，但但并不是是所有的的组织细细胞都能能建立传传代细胞胞。有一一些传代代细胞对对病毒敏敏感范围围较广，曾曾被利用用作病毒毒的分离离和鉴定定。如HHeLaa细胞，HHep2细胞胞及KBB细胞。HHeLaa细胞对对脊髓灰灰质炎三三型病毒毒，腺病病毒及大大多数实实验室适适应的EECHOO病毒都都敏感。HHep2细胞胞也曾用用来分离离脊髓灰灰质炎病病毒、柯柯萨奇AA组病毒毒、腺病病毒、RRS病毒毒。HeLa细细胞来自自子宫颈颈癌，

26、HHep2细胞胞来自喉喉癌，而而KB细细胞来自自上腭癌癌。由于于传代细细胞有致致肿瘤作作用，目目前仅用用做病毒毒的分离离鉴定及及一些病病毒学的的研究而而不能用用于疫苗苗的生产产。【材料】单层细胞培培养瓶，营营养液，00.255胰蛋蛋白酶溶溶液，无无菌吸管管，无菌菌细胞瓶瓶。【方法】1将成片片细胞的的生长液液倒掉，用用Hannks液液洗一次次。2加入适适量的00.255胰蛋蛋白酶，37孵育1分钟。3将细胞胞瓶倒放放，细胞胞在上，胰胰酶在下下，继续续孵育3375110分钟钟。4将胰蛋蛋白酶倒倒掉，再再加入原原量的生生长液，用用10毫毫升吸管管吹打分分散细胞胞。5用生长长液按原原量34倍稀稀释，即即

27、一瓶细细胞能传传344瓶。细胞培养接接种病毒毒的方法法及病变变观察（示示教）【材料】单层细胞培培养管、营营养液、HHankks溶液液、无菌菌毛细滴滴管和腺腺病毒稀稀释液。【方法】1取已长长成单层层细胞的的培养瓶瓶二只，用用无菌毛毛细滴管管吸去管管中液体体，用HHankks溶液液洗二次次。2用无菌菌的1毫毫升吸管管吸稀释释的腺病病毒液00.1毫毫升加入入一只单单层细胞胞培养瓶瓶中，另另一只加加0.11毫升营营养液不不接种病病毒作为为对照，细细胞瓶放放平，使使其接触触整个细细胞层，置置37作用11小时，使使病毒吸吸附到细细胞上。3取出单单层细胞胞瓶，每每只中加加入营养养液0.9毫升升，盖紧紧后置3

28、37孵箱中中培养112天天。4取出细细胞在低低倍显微微镜下观观察，注注意种毒毒与对照照二管的的细胞形形态，排排列等。注：为方便便保存，此此处观察察的细胞胞已经过过固定和和染色。五、血凝抑抑制试验验血凝抑制制试验系系利用血血凝素特特异性抗抗体与病病毒表面面相应血血凝素相相互作用用，使病病毒血凝凝现象抑抑制的试试验。血凝抑制制试验适适用于具具有血凝凝素的病病毒，试试验必须须预先滴滴定病毒毒的血凝凝效价，然然后采用用一定量量的病毒毒，通常常是加入入4个血血凝单位位的病毒毒，在与与血凝滴滴定试验验相同的的反应条条件下来来进行测测定。（一）血血凝效价价的滴定定【材料】收获的尿尿囊液（病病毒悬液液）、33

29、2孔有有机玻璃璃板。00.2 mll移液器器、移液液头、小小试管一一支、00.5鸡红细细胞悬液液、生理理盐水【方法】按下表进进行，其其操作程程序为：1将有有机玻璃璃板孔从从1110号进进行编号号，从第第一孔起起直至第第10孔孔，每孔孔加生理理盐水00.2ml。2将尿尿囊液在在试管中中作15稀释释，即吸吸取0.8mll生理盐盐水，加加入0.2mll尿囊液液。然后后吸取115稀释释的尿囊囊液0.2 mml加入入到第11孔，混混匀后（吹吹吸3次次），从从中吸出出0.22 mll移入第第2孔，如如此对倍倍稀释直直至第99孔，于于第9孔孔中吸出出0.22 mll，弃入入消毒缸缸内。第第10孔孔不加尿尿囊

30、液作作为对照照。3自第第10孔孔起，反反方向每每孔补充充生理盐盐水0.2 mml。自第10孔孔起，反反方向每每孔加入入0.55 鸡鸡红血球球0.44 mll，摇匀匀后放室室温静止止45分钟，观观察结果果，并确确定血（球球）凝（集集）效价价。号盐m液l*稀 000000086液l 水0 红 m.*为155稀释尿尿囊液结果观察察：凡出出现凝集集者，红红细胞平平铺孔底底，呈倒倒张的伞伞状，边边缘有卷卷起的趋趋向。凝凝集特别别显著者者为，次次之为，凝凝集清楚楚可见者者为，稍呈呈凝集者者为；阴性者者血球沉沉于孔底底中心，呈呈钮扣状状。血凝效价价：指呈呈现凝集时时病毒的的最高稀稀释度。此此时的稀稀释度即即

31、为1个个血凝单单位。若若1个血血凝单位位为16400，则44个血凝凝单位为为11600。（二）血血凝抑制制试验【材料】4个血凝凝单位的的病毒液液，15稀释释的抗血血清，332孔有有机玻璃璃板，00.2 ml移移液器，移移液头，00.5鸡红细细胞悬液液，生理理盐水【方法】按下表进进行，其其操作程程序为：1将有有机玻璃璃板孔从从1110号进进行编号号，从第第一孔起起直至第第9孔，每每孔加生生理盐水水0.2ml，第第10孔孔加0.4mll。2于第第1孔和和第8孔孔中各加加入15稀释释血清00.2mml。将将第1孔孔混匀后后从中吸吸出0.2mll移入第第2孔，如如此作对对倍稀释释直至第第7孔，于于第7

32、孔孔中吸出出0.22ml弃弃入消毒毒缸内。第第8孔为为血清对对照。3于第第1至第第7孔中中各加入入0.22ml 4个血血凝单位位的病毒毒液，第第9孔亦亦加入00.2mml病毒毒液作病病毒对照照。4稍加加振摇后后，每孔孔加入00.5鸡红细细胞0.4mll，室温温静置445分钟钟，观察察结果。胞盐m清m* 2*稀 20血 位 m. 红 悬m.*为155稀释的的抗血清清结果： 胞 孔血血球沉于于孔底中中心，呈呈钮扣状状，表明明红细胞胞无自凝凝现象；病毒对对照孔，呈呈现凝凝集，表表明病毒毒血凝功功能正常常；血清清对照孔孔，血球球沉于孔孔底中心心，呈钮钮扣状，表表明血清清中无凝凝集因子子；测定定孔中，如

33、如血球沉沉于孔底底中心，呈呈钮扣状状，表明明血清中中有相应应的血凝凝抑制抗抗体，为为阳性孔孔；反之之凝集者者为阴性性孔。血凝抑制效效价：呈呈完全血血凝抑制制时的最最高血清清稀释度度。附录：附录：1鸡胚的的准备和和发育过过程病毒的鸡鸡胚培养养，多采采用来亨亨鸡卵，其其优点为为卵壳色色白而薄薄，易于于照视，如如不能得得到，一一般家鸡鸡卵也可可应用。孵孵育温度度通常在在3839之间，相相对湿度度4060。孵育育455天后即即可在检检蛋灯上上检查鸡鸡胚受精精与否及及发育情情况。未未受精之之鸡蛋于于4日后后仅见模模糊卵黄黄黑影，无无鸡胚迹迹象。活活的鸡胚胚于4日日后即可可见清晰晰之血管管小网，中中有刚刚

34、刚发育之之胚胎，自自455天以后后逐日检检查胚胎胎生活情情况，逐逐日增大大之鸡胚胚则可见见到清楚楚之绒毛毛尿囊膜膜上的血血管及活活动之胚胚胎。受精卵在在通过输输卵管时时，已开开始分裂裂，当产产卵时已已在卵黄黄中形成成细胞，名名为胚点点，在适适宜温度度下即能能继续分分裂发育育，形成成中、外外、内三三胚层，逐逐步发育育成各种种器官。鸡胚的最最外层为为石灰质质之卵壳壳，上有有细孔以以行气体体交换，下下层为壳壳膜，很很容易与与孵壳分分开，壳壳膜的功功能是使使气体分分子和液液体分子子在内外外两方面面进行交交换，因因此在孵孵育鸡胚胚时需要要一定的的湿度和和气流，如如果湿度度太低，鸡鸡胚就容容易脱水水，引起

35、起鸡胚死死亡，气气流同样样是重要要的，孵孵育时如如空气不不流通，亦亦可造成成鸡胚的的死亡。因因此壳和和壳膜不不是简单单的覆盖盖，而是是本身具具有维持持内部生生命的功功能。气气室的功功能是呼呼吸和调调节压力力，壳膜膜之下为为血管丰丰富的绒绒毛尿囊囊膜，外外为绒毛毛膜，系系外胚层层形成，内内为尿囊囊膜，由由内胚层层形成，两两膜结合合之间为为中胚层层，因此此绒毛尿尿囊膜是是尿囊膜膜在生长长发育过过程中与与绒毛膜膜相连而而成，血血管较多多，起着着胚胎呼呼吸器官官的功能能，氧气气的交换换是在膜膜的血管管内通过过卵壳孔孔而进行行的。鸡鸡胚孵育育至第33天即出出现尿囊囊，为直直肠腹侧侧部分的的膨出物物，尿囊

36、囊腔是胚胚胎的排排泄器官官，内含含尿囊液液，初为为透明液液体，是是单纯生生理盐水水溶液，以以后尿囊囊液中尿尿酸盐迅迅速增加加，胚胎胎发育到到第122133天，尿尿囊液开开始变得得浑浊，若若将其冷冷却即可可见有沉沉淀物形形成，主主要是尿尿酸盐类类。因此此，在制制备流感感病毒抗抗原时，通通常用盐盐水将尿尿液加以以稀释后后放4备用，这这样可减减少尿酸酸盐的沉沉淀，尿尿液量在在鸡胚发发育的第第11至至13天天最高，平平均为666.5毫升升。羊膜为胚胚胎最内内层包被被，系由由外胚层层组成，羊羊膜腔盛盛有羊水水，胎体体浸泡于于其中，羊羊水在起起初是单单纯的生生理盐水水，后来来则蛋白白质含量量增加，羊羊水量

37、平平均为11毫升左左右。卵黄囊附附着于胚胚胎，卵卵黄囊膜膜系由内内胚层的的细胞组组成，对对培养病病毒有重重要作用用，内包包有卵黄黄，为胚胚胎之养养料，卵卵白位于于卵之锐锐端，为为胚胎发发育晚期期之养料料。2Haankss溶液配配制，先先配成下下列甲、乙乙两种原原液。原液甲：NaaCl1600克 KCCl8克 加入8800毫毫升双蒸蒸水MggSO447H2O2克MggCl22H2O2克CaaCl22 2.88克溶于于1000毫升双双蒸水将上述二二溶液混混合后加加双蒸水水至10000毫毫升，加加2毫升升氯仿作作为防腐腐剂，保保存于44冰箱。原液乙：Naa2HPOO412HH2O3044克KHH2P

38、O41.22克 加入入8000毫升双双蒸水葡萄萄糖20克克04酚酚红液 1000毫升加入双蒸蒸水使成成10000毫升升，加入入2毫升升氯仿作作为防腐腐剂，保保存于44冰箱，使使用前按按以下比比例配成成。原液甲1份原液乙1份双蒸水18份份以9磅100分钟灭灭菌，此此溶液存存于4冰箱，可可使用11个月。3营养养液的配配制Hankks液10000毫升升水解乳白白蛋白5克配制成00.5之水解解乳白蛋蛋白溶液液，分装装小瓶以以9磅100分钟灭灭菌，使使用前再再加入55100无菌菌牛血清清，并调调整pHH（用NNaHCCO3溶液校校正）。40.25胰蛋白白酶溶液液配制胰酶2.55克Hankks使用用液10

39、000毫升升青霉素10毫毫升（最最终浓度度1000单位/毫升）链霉素10毫毫升（最最终浓度度1000单位/毫升）加胰酶和和抗生素素于Haankss液中，震震荡使其其溶解，加加压过滤滤除菌，分分装，20低温备备用，一一瓶最好好用一次次，不宜宜反复冻冻融。3流感病病毒的分分离和鉴鉴定过程程：【材料】患者早期期漱口液液（用大大管肉汤汤收集）、9910日日龄鸡胚胚、1毫毫升注射射器及针针头（116号）、抗抗生素（每每毫升含含青霉素素2万单单位及22万微克克链霉素素）、无无菌小试试管、吸吸管、00.5鸡红细细胞、已已知各型型流感免免疫血清清。【方法】 病人人急性期期的漱口口液 （抗抗生素处处理） 活鸡胚胚培养（羊羊膜腔接接种） 孵孵育355