生物医学电镜技术与细胞及组织超微结构总论课件

1、生物医学电镜技术与细胞及组织超微结构Biomedical Electron Microscopy and Cell & Tissue Ultrastructure重庆医科大学电子显微镜室10/1/20221 电子显微镜（Electron Microscope , EM)简称电镜，它是用电子束代替可见光的显微装置，一种高放大、高分辨的大型精密仪器。目前电镜已广泛应用于医学、生物学、农业、工业、军事等多个领域。 EM在光学显微镜基础上使细胞学的概念更加完善，对疾病的认识,特别是对发病机理的研究做出了巨大贡献。绪 论10/1/20222（一）、电镜技术发展简史、Robert Hooke(1665)

2、& Leeuwenhoek(1674)发现细胞；、19世纪30年代,Schleiden(1938) & Schwann（1839）提出 细胞学说(cell theory)；、1932年，德国Knoll & Ruska建造第一台电镜(Electron Microscope,EM, 12);19331934年,电镜的性能已达光镜的分辨率0.2um, 10,000；1938-1939，第一批商品电镜问世，分辨率达100A； 由于受到样品制备技术的限制，20世纪50年代初，电镜技术才开始运用于生物医学方面的研究。、细胞超微结构的分子细胞生物学的基础。10/1/20223(二)、分辨率与形态研究的关系1

3、、分辨率（Resolution） 又称分辩本领（Resolving power），是将邻近两点清晰区分、辩认的能力，用能被辨认的邻近两点的距离表示。 肉眼：在明视距离（25cm）时，为0.25mm； LM：可见光的平均波长为500nm，r=/2，LM的极限分辨率为0.25um; EM：电子波波长短,且波长随加速电压的增高而更短，目前较好的电镜分辨率为0.2nm左右,比LM提高1000倍,比人眼提高100万倍. (注)：由于电镜存在各种像差（包括球差、像散等）,限制了分辨率,不能真正达到其波长的一半; 分辨率还受到许多因素的影响,如切片的厚度等，超薄切片较薄 时,分辨率可达12.5nm,切片较厚

4、时,实际分辨率为510nm. 10/1/202242、反差： 被观察物与其背景在亮度（黑白对比度）上有所不同，这种差别称为反差；透射电镜的反差主要由样品对电子的散射产生。3、空放大 不能提供更为清晰的图像放大，称为无效放大，也称无效放大。4、不同分辨率的形态研究10/1/20225(三)、基本原理、构造及电镜的类型电镜的基本构造及原理、电子束主要特点： a、由电子组成，真空中直线前进，具波动特性； b、电子束受电力和磁力作用； c、电子束照射样品时，能透过极薄样品，得到透射电子，或产生二次电子，特征X射线，背散射电子等。10/1/20227、电镜的基本构造：以透射电镜为例 10/1/20228

5、、超高压电镜（High Voltage Electron Microscope, HVEM）； 常规电镜加速电压一般在200KV以下，如果加速电压在500KV以上，则称为HVEM。 特点:观察厚切片(0.5-3um)，提高分辨率。观察到原子水平，期望观察生活标本（含水份）、分析电镜（ Electron Microscope Microanalyser， EMMA）； I、波谱仪（wavelength-dispersive spectrometer ， WDS） II、能谱仪（energy-dispersive spectrometer ，EDS） 、扫描探针显微镜(Scanning probe

6、 microscope,SPM): 原子力显微镜(atomic force microscope,AFM)； 扫描隧道显微镜(scanning tunneling microscope,STM)。10/1/20221010/1/20221110/1/20221210/1/20221410/1/202215、扫描电镜的二次成像原理 扫描电镜一般可分为四个重要的组成部分： a、形成电子探针的电子光学系统； b、探针的电子束打击样品表面形成信息信号； c、检测系统； d、电子偏转系统（是电子探针在样品表面按一定顺序扫描，并且使这一扫描过程与阴极射线管的电子束在荧光屏上移动同步）。10/1/20221

7、710/1/202218扫描电镜的结构示意图：10/1/20221910/1/20222010/1/20222110/1/20222210/1/20222410/1/202225(四)、细胞超微结构研究的展望、二维 三维，如三维重建技术；、从单纯的形态观察,深入到对其功能、代谢、化学组成、分子结构及元素分布的研究。如X线显微分析(electron probe x-ray microanalysis)；、定性描述 定量测定方向发展，如电镜形态测量技术（morphometry）；、从经化学固定的结构向活细胞整体方向发展，如超高压电镜技术的应用；、仪器设备向小型化方向发展。10/1/202227本课

8、程的重点内容电镜生物样品制备常规技术及应用范围;电镜图片的分析要领;正常细胞超微结构理论和超微病理内容的基本掌握。学习要点重视图像的分析和识别；注意LM和EM结合；形态与功能的联系；正常超微结构与超微病理的联系；建立整体的细胞结构和功能概念。主要参考文献电子显微镜术在临床医学的应用,杭振镳 蔡文琴主编,重庆出版社,1988年8月,第一版；医学细胞生物学,宋今丹主编,人民卫生出版社,1997年5月,第一版；医用电子显微学，薄爱华主编,人民卫生出版社,2000年11月,第一版；超微病理学基础,武忠弼主编,人民卫生出版社,1990年9月,第一版；Ultrastructural Pathology o

9、f the Cell and Matrix . Third Edition Vol.1 Feroce N,Ghadially Butterworths 198810/1/202228电镜生物样品制备技术 样品制备是电镜技术中一个很重要的组成部分，是电镜工作中最繁重的环节。要学习掌握好细胞超微结构知识及应用电镜技术进行研究工作，都必须首先了解电镜的标本制备技术，故属于本课程的重点内容。10/1/202229（一）、超薄切片及其染色技术超薄切片（ultrathin-section）制备过程示意图：10/1/2022301、取材的基本原则： 快：1min 小：1mm3 利： 静： 冷：4 取材部位要

10、准确； 成批取材，部位一致、； 标本的编号和标签。10/1/2022312、固定：、几种常用的固定剂的理化特性和使用原则： a、四氧化锇（Osmium tetroxide，OsO4）； 又称锇酸，是电镜生物样品使用最广泛的固定剂，兼有电子染色作用，可作单固定，一般不用于电镜细胞化学实验的固定。对糖原和核酸的保护作用差。多用于后固定。 b、戊二醛（glutaraldehyde，C5H8O2）； 不能单独作为电镜样品固定液，对脂肪的保护作用差。没有“电子染色”的作用，通常用于前固定。 c、甲醛（formaldehyde）。 电镜多用多聚甲醛，对酶活性保存好，可与戊二醛混合或单独用于细胞化学灌流固定

11、或作为前固定液。、固定方法： a、双重固定法； b、体内原位固定法； c、灌流固定法。 10/1/2022323、脱水：应递增浓度进行4、浸透：半浸透 纯浸透5、包埋、聚合：环氧树脂（epoxy resin）618#，Epon8126、切片：修块 光切（半薄切片，0.5-1um） 定位 超切(超薄切片,50-70nm) 超薄切片机(ultramicrotome)，玻璃刀，钻石刀，复有支持膜的载网（grid）（铜、镍、金网）。10/1/2022337、电子染色：利用重金属离子对不同细胞结构的结合能力不同，使各细胞结构对电子产生不同散射程度，以增强明暗之比（反差）。 常用的电子染色剂有以下几种 a

12、、醋酸铀（Uranyl acetate），即醋酸双氧铀，多用于块染； b、枸橼酸铅（Lead citrate），用于片染，易被空气中的CO2污染。 电子密度（electron density）的概念：10/1/202234（二）、负染技术 利用高密度无结构的重金属物质把生物标本包绕起来。这种反差是负像（与正染色的超薄切片相比较）。最常用的染色剂是磷钨酸钠（phosphotungstic acid，PTA），此法常用于病毒、蛋白分子或细胞亚单位的分子结构研究，制样简单，可作快速诊断。10/1/202235（三）、电镜细胞化学技术（electron microscopic cytochemistr

13、y） 在保持细胞超微结构完整的条件下，借助细胞中的化学反应，研究细胞乃至细胞器的结构与功能的关系，是与化学、生物化学及免疫学有密切联系的一门学科。广义的电镜细胞化学研究方法主要有细胞超微标记示踪技术、电镜酶细胞化学技术和电镜免疫细胞化学技术（简称免疫电镜技术）等几种。10/1/202236 1、电镜酶细胞化学术(electron microscopic cytochemistry of enzyme or ultracytochemistry of enzyme)基本原理及内容: 酶细胞化学术（enzyme cytochemistry）是利用酶催化反应特点，从亚微结构上研究酶的分布和活性。按其

14、催化反应的性质可分为水解酶、氧化还原酶、转移酶、裂解酶、合成酶和异构酶六大类，应用较多的有水解酶和氧化还原酶。现以水解酶为例，介绍此技术的主要过程和基本原理。初级反应：底物被磷酸水解酶作用后分解产生磷酸。 底物 磷酸水解酶 H3PO4 最终反应：磷酸与金属捕捉剂结合形成反应产物。 H3PO4 捕捉剂（如Pb2+） Pb3(PO4)2 反应产物为电子致密的沉淀物，电镜下易于观察并显示出酶的定位。近年来常用铈（ Ce3+）作为捕捉剂。10/1/20223710/1/202238 应用 一般说透射电镜已能分辨出超微结构和某些化学成份，如糖原颗粒、核糖体、染色质和脂类等。电镜酶细胞化学则着重显示各超微

15、结构的酶特别是标志酶，研究细胞器的化学、功能及其动态变化，由于电镜方法的限制，迄今所能显示的酶为数尚少。 酶细胞化学技术主要用于：（1）酶在超微结构上的定位，（2）标记和鉴定某些细胞和细胞器，（3）通过显示过氧化物酶，定位示踪HRP,（4）利用免疫酶技术，电镜下显示特异性标记物的定位。 目前应用电镜技术常显示的标志酶有：各种细胞器的标志酶细胞器标志酶内质网核苷二磷酸酶，葡萄糖-6-磷酸酶高尔基体焦磷酸硫胺素酶（Trans膜囊）、烟酸胺腺嘌呤二核苷磷酸酶（中间膜囊）溶酶体酸性磷酸酶微体过氧化氢酶线粒体细胞色素氧化酶、琥珀酸脱氨酶细胞膜核糖核苷磷酸酶（如ATP酶）、碱性磷酸酶10/1/202239

16、Figure 10 G-6-Pase reaction products were rich in Leydig cell of the control group rats. 20 000Figure 11 G-6-Pase reaction products decreased markedly after 3 d of cadium treatment. 20 000Figure 12 Showing intense G-6-Pase reaction products of Leydig cell after 3 d of cadium add zinc treatment. 20 0

17、0010/1/20224010/1/202241RER,G-6-PasePlasmalemma , AlPMito., SDH10/1/2022422、 免疫电镜技术(immunoelectronmicroscopy) 免疫细胞化学术（immunocytochemistry）是用标记特异性抗体对组织内抗原分布进行形态学研究的一门分支学科。60年代，Nakane建立了酶标记抗体技术，70年代，Sternberger在此基础上改良并建立了非标记过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）技术，80年代Hsu建立了抗生物素-生物素（ABC）法之后，胶体金标记技术、免疫金银染色和亲和免疫细胞化学技术等相继问世，

18、使免疫细胞化学技术成为当今生物医学中形态、功能、代谢综合研究的一项有力工具。目前免疫细胞化学正在向定量和分子水平发展。10/1/202243 常用免疫电镜方法的原理及步骤PAP法 基本原理： PAP（peroxidase-antiperoxidase）法，又称可溶性酶-抗酶法。特点为参加反应的抗体都不被酶直接标记。包括以下步骤：用第一抗体（Ab1）与组织中特异性抗原（Ag）相结合形成抗原抗体（AgAb1）复合物；用第二抗体（Ab2）的一个Fab段与第一抗体结合，另一个Fab段游离，形成抗原-第一抗体-第二抗体（Ag-Ab1-Ab2）复合物；用过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物（PAP，与Ab1同种

19、动物的血清）与第二抗体的游离Fab段结合，形成Ag-Ab1-Ab2PAP复合物；用过氧化氢和二氨基联苯胺（DAB）使PAP的过氧化物酶形成不溶的、暗棕色的嗜锇化合物。 优点： 保存抗体活性好；PAP复合物稳定；敏感性高，比间接免疫荧光抗体法敏感性高1001000倍；由于敏感性高,节约了抗体用量,也减少了非特异性背景染色。 缺点：反应产物颗粒较大，遮盖背景；DAB有致癌作用，操作中需格外小心；内源性氧化酶对此法有干扰。10/1/20224410/1/202245 ABC法 基本原理： 抗生物素-生物素-过氧化物酶复合物技术（Avidin-Biotin-Peroxidase Complex Tec

20、hnique）简称 ABC技术，是目前常用的免疫细胞化学技术之一。1979年Guessdon首先把生物素-卵白素技术用于免疫组织化学，先后设计出桥式卵白素-生物素（BAB）技术和标记式卵白素一生物素（LAB）技术，1981年Hsu和许世明在BAB法和LAB法基础上改良而建立了ABC法，其基本原理与PAP法相似，特点是利用抗生物素分别连接生物素标记的第二抗体和生物素标记的过氧化物酶，形成抗原-第一抗体-生物素标记的第二抗体-抗生物素过氧化物酶复合体（AgAb1Ab2ABC）。抗生物素又称卵白素（Avidin），它有四个活动结合点，并与生物素有特别高的亲和力，一旦和生物素结合就极为稳定。当生物素和

21、第二抗体共价偶联后，就使第二抗体获得与抗生物素相结合的能力。10/1/20224610/1/202247 胶体金标记技术 优点：（l）胶体金可标记各种不同的生物大分子(如免疫球蛋白、葡萄球菌A蛋白、植物凝集素、刀豆球蛋白A等)，并使其保持原有的生物学活性。（2）胶体金标记技术可适用于光镜、透射及扫描电镜、X射线能谱分析、荧光显微镜等。（3）胶体金非特异性吸附作用小、特异性强。（4）金颗粒电子密度大，电镜下检出率远比DAB反应产物高，敏感性比PAP法高20200倍、比ABC法亦高数倍。（5）胶体金标记物是颗粒状物，电镜下易于计数，可直接定量检测抗原。（6）胶体金标记不受内源性物质影响。（7）胶体

22、金颗粒直径可根据需要控制，将不同直径的肢体金分别标记不同抗体或抗原，可在同一张切片上同时区分两种或两种以上的抗原或抗体，特别适合于电镜水平的双标记或多标记。（8）胶体金标记和IGSS特别有利于回顾性研究,如过去病理外检的石蜡切片和电镜包埋块,需要时可进行胶体金标记研究。胶体金的颗粒较大,穿透性弱,是它的主要缺点。 电镜水平的免疫金技术，同PAP和ABC法免疫电镜一样，关键在于抗原的保存。用L.R.White 和 Lowicryl K4M包埋，其保存抗原优于Epon812，用冷冻超薄切片作IGS，由于抗原性保存很好，更易成功。目前多采用包埋后染色。包埋前染色，免疫金试剂对细胞膜的穿透性差,一般只

23、用于细胞表面抗原的标记。10/1/20224810/1/202249（四）、真空喷镀和离子溅射技术真空喷镀： 真空条件下金属加热至一定温度后，将以细颗粒向四周发射，在样品面对喷镀源的一面形成一层重金属薄膜。又称金属投影法（metal shadowing）。离子溅射： 与真空喷镀的区别在于：真空度不同，重金属离子运动的方向不同，镀膜效果较前者好，金属用量可少10倍，镀膜更为均匀。10/1/202250（五）、冷冻蚀刻技术（freeze etching）及冷冻割断技术（freeze fracture） 冷冻蚀刻技术又称冷冻蚀刻复型法（freeze etching replica），该技术主要用于生

24、物膜内部及细胞内部三维结构的研究，如核孔复合体、细胞连接等。10/1/20225110/1/20225210/1/202253（六）、扫描电镜样品制备技术 10/1/202254（七）、电镜X线显微分析术（electron microscopic X-ray microanalysis） 又称电子探针X线显微分析（electron probe X-ray microanalysis）或简称X线微区分析（X-ray MA），是电镜技术与X线分析技术相结合的一种方法。 基本原理： 当高速电子束轰击固体标本表面的微小区域，使该区域所含的元素发射X线，各种元素都能发射自己的特征X线，通过检测发射的X线

25、的波长和强度，便可了解该微小区域所含元素的种类及含量。 分析仪器包括： a、电子探针显微分析仪； b、扫描电境与X线检测器的结合； c、扫描透射电境与X线检测器的结合； d、专用分析电镜（electron microscope microanlyser，EMMA）； e、透射电镜与X线检测器的结合。10/1/202255优点： 、分析过程不破坏样品结构，在保持各元素原有分布情况下对生物细胞内各种元素同时进行分析； 、结合拍摄透射或扫描电镜图像，可在形态观察的同时对一定结构内的元素进行测量，从而获知超微结构变化与其组成元素变化的关系。 、灵敏度高，可辨别1um3区域内质量小于10-14g的元素。

26、应用： 中药研究，钙库研究，重金属中毒（如镉）研究等。10/1/202256(八)、电镜细胞立体形态计量技术 用立体学方法来分析形态结构，称为形态计量学（morphometry）或体视学，形态定量分析目的是从二维图像推导出三维结构参数。 人工法； 生物医学图像分析系统（九）、扫描血管铸型（casting）技术 观察和研究腔隙性器官，特别是器官内的血管立体构筑和分布情况。 铸型剂-甲基丙烯酸酯 样品经腐蚀，清洗，镀膜后在SEM下观察。（十）、特殊样品制备甲醛固定石蜡包埋样品；培养细胞及游离细胞；血液（白细胞、血小板），精液等液体标本； 骨组织。 10/1/20225710/1/202258电镜技

27、术在生物医学中的应用基础研究方面： 在病毒学、细胞生物学、组织学、病理学、分子生物学及分子病理学上均做出了卓有成效的贡献。如核蛋白体超微结构的研究；核蛋白体与mRNA关系的阐明；核小体的发现；DNA复制及RNA转录的分子形态观察；线粒体内膜的ATP合成酶颗粒的发现；电镜是直接观察病毒的唯一工具。临床医学方面： 电镜在医学上的应用近10多年来已从医学基础性理论研究逐渐扩大到临床医学的实际应用方面。对疾病的病情、病因的鉴定，对肿瘤、血液病及肾脏病等的分型诊断上都取得显著成效。由于内窥镜的应用和穿刺技术的发展，使得临床上获得如心脏、肝、肾、胃等脏器的标本变得较容易。10/1/20225910/1/2

28、02260正确评价电镜的使用： 电镜是一种先进的科学仪器，其主要特点是分辨率高，能观察细微结构。但正是由于其高放大，使得观察范围较小，且制样复杂。而光镜则有制样简单，观察面大，能动态观察活细胞等优点。因此电镜不能取代光镜，二者应配合使用，取长补短。在科学研究中，电镜所起作用具体表现为： a、探查作用：观察很早期的改变，功能活动的提示，因复杂的代谢过程中的定位往往是光镜看不见的；病毒学、病因学、免疫损伤等病因的探讨； b、依据作用：“眼见为实”的重要性，在机理研究中从形态学上证实了许多理论假说； C、辅助作用：电镜结果注意与光镜的关系，与宏观的关系，因其本身有较大的局限性，如取材小，观察范围亦小，特别是在病理诊断上应与其他方法结合进行研究。 10/1/202261观察要领1、正确判断和应用放大倍率： 原则：从低倍到高倍，以利于判断细胞组织种类，医学生物学范围内多用1-2万倍，多数问题在5万倍以下就能解决。 电子放大，光学放大，总放大的概念。2、具有全局的观点： 注意宏观提示，光镜和其他检查结果，防止片面性；电镜观察时注意连续追踪，仔细全面，一定要有严格的正常对照；提倡2人以上同时观察。3、及时作好拍片记录和观察小结；4、重视基础理论指导： 良好的认识水平来自于坚实的专业理论知识和丰富的实践经验。电镜观察如果缺少必要的认识基础，其结果是视而不见，见而不知其义。因此必须做好文献准