骨髓检查组化免疫分型遗传学1课件

1、二、骨髓细胞学检查的内容、方法和临床意义p293二、骨髓细胞学检查的内容、方法和临床意义p293骨髓检查组化免疫分型遗传学1课件骨髓检查组化免疫分型遗传学1课件 骨髓标本采集要求标本采集的注意事项：形态检查抽吸量不超过0.2ml；同时进行多项检查应优先抽吸形态检查标本；涂片厚薄适宜，不少于4张，并同时制作配套的血片； 作好标记；如干抽，此时应考虑作骨髓活检；多部位或对有压痛点或根据X线检查提示进行穿刺，以提高阳性率 。 骨髓标本采集要求 判断骨髓取材成功的标准抽吸骨髓液时，病人有特殊酸痛感；有骨髓小粒和脂肪滴；显微镜下可见到骨髓特有细胞，如巨核细胞、成骨细胞、破骨细胞、浆细胞、组织嗜碱细胞、纤

2、维细胞和大量红系、粒系幼稚细胞等。判断骨髓取材成功的标准抽吸骨髓液时，病人有特殊酸痛感；骨髓涂片、染色：Wright或Giemsa染色、双染色法返回骨髓涂片、染色：Wright或Giemsa染色、双染色法返二、骨髓细胞学检查的内容、方法和临床意义、低倍镜检查1、确定骨髓标本的取材和涂片制作是否满意 骨髓穿刺液制成涂片后，肉眼观察，在涂尾部见到散在的约粟粒大小呈浅肉色半透明的骨髓小粒及少量脂肪小滴；在显微镜下见到较多骨髓特有的细胞如各系幼稚细胞及巨核细胞等，是穿刺成功的标志。 如骨髓小粒较少或缺如，骨髓特有成份减少，提示骨髓可能有不同的外周血液稀释，为取材不良 如脂肪滴增多，则表示红髓成份减少，

3、反映骨髓增生减低插图二、骨髓细胞学检查的内容、方法和临床意义、低倍镜检查插图 2、判断骨髓增生程度（表4-2-7）骨髓增生程度通常以骨髓中有核细胞的量来反映。采用五级法 2、判断骨髓增生程度（表4-2-7）骨髓增生程度分级 有核细胞：成熟红细胞有核细胞占全部细胞百分率有核细胞/1000个成熟红细胞常见原因范围平均范围平均极度活跃1:0.52.01:150238.96521.07351.96白血病明显活跃1:5121:101043.78230.77114.51增生贫血增生活跃1.16321:20111021.5363.6735.34正常骨髓增生减低1:35701:500.517.4119.611

4、0.53慢性再障明显减低1:3001:200100/HP返回骨髓增生程度分级(高倍镜）明显减低增生减低增生活跃明显活跃极3、观察巨核细胞需要注意数量、成熟程度、产血小板功能及其形态（包括血小板的形态）等四个方面。低倍镜下计数全部片膜的巨核细胞数。并转换油镜观察，进行分类计数，注意巨核细胞及血小板的形态有无异常。4、注意有无异常细胞如恶性组织细胞病的异常组织细胞、转移癌细胞、Gaucher细胞、Niemann-Pick细胞等。注意观察有无散在或成堆分布的体积较大、形态特殊的异常细胞出现，尤其应注意涂片尾部、边缘及骨髓小粒周围。发现可疑异常细胞，应在油浸镜下观察加以确认。 3、观察巨核细胞 二、骨

5、髓细胞学检查的内容、方法和临床意义、油浸镜检查选择有核细胞分布均匀、结构清晰、着色良好的涂膜体尾交界处部位作油浸镜检查。1、有核细胞分类计数在油浸镜下连续分数200个或500个有核细胞，按细胞的不同系列和不同的发育阶段分别计数。然后计算出分别占有核细胞总数的百分数。再累计粒系和红系总数，计算粒红比例（G:E）。分类计数时，巨核细胞及分裂、退化细胞不计入。2、观察细胞形态仔细观察各系列细胞的形态有无异常，包括注意成熟红细胞的形态有无异常，有无特殊异常细胞出现，必要时还需注意有无寄生虫。插图二、骨髓细胞学检查的内容、方法和临床意义、油浸镜检查插图、检查结果的临床意义1、骨髓增生程度，其临床意义如前

6、表所述。2、骨髓中各系列细胞及其各发育阶段的比例粒细胞系统：约占有核细胞的5060%红细胞系统：约占有核细胞的20% 粒红比例（G/E）2.760.83:1(2-4:1)淋巴细胞系统：约占有核细胞的20%单核细胞系统：一般4% 浆细胞系统：一般2%巨核细胞系统：735个为正常值(1.5*3cm涂片）。其他细胞：可见到极少量的非造血细胞成分、检查结果的临床意义3、各系列细胞比例改变的临床意义、粒细胞系与红细胞系比例（粒/红比例）1)、粒红比例正常：见于：正常骨髓象；粒、红两系平等增多或减少，前者如红白血病，后者如AA；粒、红两系细胞基本不变化的造血系统疾病，如MM、骨髓转移癌、ITP等。2)、粒

7、红比例增高：指粒/红比例大于5:1。可见粒细胞系增多，或由红细胞系减少所致。常见于：急性或慢性粒白血病； 急性化脓性感染、中性粒细胞性类白血病反应； 纯红再障。3)、粒红比例减低：指粒/红比例小于2:1。可见粒细胞系减少，或由红细胞系增多所致。常见于： 粒细胞减少，如粒缺；红细胞系增多，如各种增生性贫血、真红或继发性红细胞增多症等。3、各系列细胞比例改变的临床意义、粒细胞系统：1)、粒系细胞增多：见于：各型粒细胞白血病，急性粒细胞白血病以原粒细胞及早幼粒细胞增多为主，CML以中性晚幼粒及杆状核粒细胞增多为主；大部分急性炎症和感染性疾病、中性粒细胞性类白反应等，以中性晚幼粒及杆状核粒细胞增多为主

8、。2)、粒细胞减少：见于AA、粒细胞缺乏症或粒细胞减少症。、红细胞系统：1)红系增多：见于： 各类增生性贫血如溶血性贫血、失血性贫血、小细胞低色素性贫血等，以中幼红及晚幼红细胞增多为主； 巨幼细胞、粒细胞系统：贫血，以巨幼红细胞增多为主；急性红白血病，以原红及早幼红细胞增多为主，并常伴幼红细胞巨幼样变。2)、红系减少：见于AA（包括PRCA），但部分CAA，骨髓呈灶性增生者，有时可见红系细胞比例增多。、淋巴细胞系统：1)、淋巴细胞绝对性增多：见于急淋和慢淋、恶性淋巴瘤、传淋和传单、其他病毒性感染、淋巴细胞类白等。2)、淋巴细胞相对性增多：见于AA、粒缺或粒细胞减少症。、单核细胞系统：增多见于：

9、血液系统疾病如急单、急粒-单、MDS、恶组、淋巴瘤等；某些感染性疾病结核病、布鲁菌病、原虫感染、贫血，以巨幼红细胞增多为主；急性红白血病，以原红及早幼红细感染性心内膜炎等；风湿性疾病如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎；其他如恶性肿瘤、肝硬化、药物反应等。、浆细胞系统：增多见于：MM、浆细胞白血病、巨球蛋白血症、重链病等；反应性浆细胞增多如慢性炎症及感染性疾病、风湿性疾病、恶性肿瘤、过敏性疾病等；AA、粒缺等。、巨核细胞系统：1)、增多：ITP、Evans综合征； 骨髓增殖性疾病，如CML、真红、ET、IMF等；脾功能亢进；巨核细胞白血病。2)、巨核细胞减少：见于AA、AL及其他骨髓浸润或破坏的疾

10、病，以及急性感染、化学物或药物中毒、放射病等。感染性心内膜炎等；风湿性疾病如系统性红斑狼疮、类风湿性关节二、骨髓细胞学检查的内容、方法和临床意义、血涂片的观察在检查骨髓时，需同时进行血涂片的观察1、应注意WBC分类计数及形态观察；2、注意成熟RBC的形态有无异常。有核红。3、估计PLt数量及注意其形态有无异常；4、观察寄生虫有无（如疟原虫）。、填写检查报告单根据骨髓象和血象检查结果，按检查报告单的要求，逐项详细填写及描述骨髓象、血象表现的特征，结合临床资料提出形态学诊断意见。二、骨髓细胞学检查的内容、方法和临床意义、血涂片的观察低倍镜观察（取材 涂片 有核细胞增生 巨核细胞 病理细胞）油镜观察

11、 骨髓有核细胞分类计数200500个 细胞系形态学观察 粒系 红系 单核系 淋巴系 浆系 其他细胞 计算结果（各细胞系百分比 粒红比值） 观察血片 组织化学染色 填写骨髓图文结果报告单 （骨髓细胞特征 血片细胞特征 组化特征 ） 骨髓片存档保存骨髓象分析步骤示意图低倍镜观察（取材 涂片 有核细胞增生 巨核细胞 病理细返回返回三、血细胞的细胞化学染色意义：1、有助于了解各种血细胞的化学组成及病理生理改变。2、可用作血细胞类型的鉴别。3、以及对某些血液病的诊断和鉴别诊断，疗效观察、发病机制探讨等均有一定价值。三、血细胞的细胞化学染色意义：（一）过氧化物酶染色（POX）【原理】 血细胞中的过氧化物酶

12、（peroxidase，POX）能分解试剂中的底物H2O2，释出新生态氧，使无色联苯胺氧化为蓝色联苯胺，后者与亚硝基铁氰化钠结合形成蓝黑色的颗粒，沉着于细胞质中。【结果】胞质中无蓝黑色颗粒者为阴性反应，出现细小颗粒、分布稀疏者为弱阳性反应，颗粒粗大而密集者为强阳性反应。【临床意义】过氧化物酶染色主要用于急性白血病类型的鉴别。 急性粒细胞白血病时，白血病细胞多呈强阳性反应；急性单核细胞白血病时呈弱阳性或阴性反应；急性淋巴细胞白血病则呈阴性反应。 因此，POX染色对急性粒细胞白血病与急性淋巴细胞白血病的鉴别最有价值。（一）过氧化物酶染色（POX）【原理】 血细胞中的过氧化物酶骨髓片POX染色骨髓片

13、POX染色骨髓片POX染色APL：呈强阳性反应AML-M4：部分呈阳性反应， 部分成弱阳性反应AML-M5：呈弱阳性ALL：呈阴性，3+4+。3、铁粒幼细胞性贫血时，铁粒幼细胞增多，并可见到环状铁粒幼细胞。 【参考值】细胞外铁观察阳性为蓝绿色沉淀+血色病+AA、铁粒幼贫血+感染+AA、铁粒幼贫血+NBM正常骨髓IDA细胞外铁观察阳性为蓝绿色沉淀+骨髓铁染色（Fe）MDS-RAS铁染色，图中所指为环形铁粒幼红细胞 骨髓铁染色（Fe）MDS-RAS铁染色，图中所指为环形铁粒幼表4-2-10几种常见急性白血病的细胞化学染色结果急淋急粒急单红白血病POX+ + + + +视合并的白细胞类型而定SB+

14、+ + + + +同上AS-D NCE + + + +同上-NAE + + + + + 同上-NAE-NaF不被NaF抑制被NaF抑制同上NAP增加减少正常或增加同上PAS + + + +表4-2-10几种常见急性白血病的细胞化学染色结果急淋急粒急四、骨髓细胞免疫学分型 细胞免疫分型也称细胞免疫标记（表型）检测，它是用单克隆抗体及免疫学技术对细胞膜表面和/或细胞质存在的特异性抗原进行检测，借以分析细胞所属系列，分化程度和功能状态的一种方法。四、骨髓细胞免疫学分型 细胞免疫分型也称细胞免疫标记骨髓细胞免疫学分型（一）检测方法1、免疫荧光法(immunof luoresence technigue

15、)2、免疫酶染色法（1）APAAP法（2）PAP法（3）ABC法（二）细胞免疫分型的临床应用1、有助于识别不同系列的细胞。如识别髓骨髓细胞免疫学分型（一）检测方法骨髓细胞免疫学分型 系细胞的抗体有CD13、CD14、CD15、CD32、CD33、CD65、CD91、CD156、CD166等。识别淋巴细胞系列的抗体有：CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD9、CD10、CD19、CD20、CD52、CD77等。识别巨核细胞和血小板的抗体有CD41、CD42、CD61等。识别红细胞系列的抗体常用血型糖蛋白A或B。2 、识别不同的淋巴细胞识别成熟T淋巴细胞的抗体有CD2、CD3

16、、CD7、CD8等。识别成熟B淋巴细胞的抗体骨髓细胞免疫学分型 系细胞的抗体有CD13、CD14、CD1骨髓细胞免疫学分型有CD19、CD20、CD22等。识别NK细胞的抗体有CD16、CD56等。识别不同的淋巴细胞除检测细胞表面的抗原外，还可以检测细胞表面的受体及细胞表面其他分子，如TCR、MHC等。3、用于检测T淋巴细胞亚群临床上常用CD3、CD4和CD8单抗检测全T（CD3）细胞，并可将外周淋巴器官和血液中T细胞分为TH（CD4+，CD8-）和TS（CD4-、CD8+）两个主要亚群，计算TH/TS比值作为骨髓细胞免疫学分型有CD19、CD20、CD22等。识别NK骨髓细胞免疫学分型机体免

17、疫状态、某些疾病诊断、病期分析、监测治疗和判断预后的参数。4、用于识别不同分化阶段的细胞CD34+、CD90+、Lin-被认为是造血干细胞的主要标志；CD34+、CD33+为造血干细胞向髓系定向的标志；CD34+、TDT+、CD10+、CD7+为T淋巴细胞系祖细胞标志；CD34+、CD19+为B淋巴细胞系祖细胞标志。根据不同抗体组合可T、B淋巴细胞区分为不同分化阶段。（参照表）骨髓细胞免疫学分型机体免疫状态、某些疾病诊断、病期分析、监测骨髓细胞免疫学分型5、有助于识别不同功能状态的细胞，如记忆T细胞高表达CD45RO、不表达CD45RA。活化T细胞不表达CD45RA，而CD25、CD2、CD4

18、5RO、CD54、CD58等均强表达。6、有助于对不同系列和不同分化阶段的细胞进行分离和研究。用免疫荧光法标记和活细胞可经流式细胞仪或免疫磁珠法将其分离出来，并使对他们的研究成为可能。骨髓细胞免疫学分型5、有助于识别不同功能状态的细胞，如记忆T骨髓细胞免疫学分型7、可用于各种白血病细胞的免疫表型分析（见“急性白血病免疫表型特点”一节）。8、可用于白血病微小残留病的检查 一个完全缓解的白血病病人骨髓细胞中，若出现CD19、CD22、CD10、CD7、CD5、CD13、CD37、CD34等任何一种抗原阳性同时伴有TdT+则诊断微小残留病存在。敏感性可高达10-4水平。（三）急性白血病细胞免疫表型特

19、点1、ALL与AML细胞免疫表型特点骨髓细胞免疫学分型7、可用于各种白血病细胞的免疫表型分析（见骨髓细胞免疫学分型2、急性淋巴细胞白血病（ALL）免疫表型特点3、急性髓细胞白血病免疫表型特点4、免疫学分类对于双表型白血病、慢性淋巴细胞白血病（CLL）、毛细胞白血病、慢性粒细胞白血病急变期细胞的分类和诊断也具有重要作用。骨髓细胞免疫学分型2、急性淋巴细胞白血病（ALL）免疫表型特ALL和AML的免疫表型CD7 CD13 CD19 CD33 HLA-DR TdT MPOe AML -/+a + - + +-c +B-ALL -+-+d -T-ALL +-b +-注： a. CD7对少部分（10%）

20、AML可阳性 b. 10%T-ALL病例HLA-DR可阳性表达 c. TdT在少数（20%）AML（M1）阳性 d. TdT对大多数成熟B-ALL是阴性ALL和AML的免疫表型CD7 CD13 CD19 CD33急性淋巴细胞白血病的免疫表型特点系列亚型主要的抗原标记系列亚型主要的抗原标记B系列早期B型CD19+,CD10T系列前T型CD7+,CD2普通型CD19+,CD10+T细胞型CD7+,CD2+前B型CD19+,胞质链+B细胞型CD19+,胞膜Ig+急性淋巴细胞白血病的免疫表型特点系列亚型主要的抗原标记系列亚急性非淋巴细胞白血病的免疫表型特点亚型典型的抗原标记亚型典型的抗原标记M0CD3

21、4,33,13+M4CD34,33,15,14,13+M1同上M5CD33,15,14,13+M2CD34,33,15,13+M6CD33,血型糖蛋白AM3CD33,13+（HLA-DR阴性）M7CD33,41,42,61+急性非淋巴细胞白血病的免疫表型特点亚型典型的抗原标记亚型典型免疫组织化学染色 AML-M2（CD33阳性，呈棕黄色沉淀）免疫组织化学染色 AML-M2（CD33阳性，呈棕黄色免疫分型（流式细胞仪）AML-M0（CD5、7、10、19、14、36、GlyA阴性） （ CD13、34、38、33、MPO、HLA-DR阳性）免疫分型（流式细胞仪）AML-M0（CD5、7、10、1

22、9、五、细胞遗传学分析五、细胞遗传学分析细胞遗传学分析 自从20世纪70年代以来由于染色体分带技术的出现，尤其是高分辨显带技术的应用，细胞遗传学研究在血液学领域内才得以迅速发展，特别是在恶性血液病的研究中不但确定了某些染色体异常与疾病发生、发展、诊断、治疗及预后有密切关系，而且染色断裂点也往往成为寻找癌基因或抑癌基因的标志。 因此血细胞染色体的检查与分析对遗传性血液病和恶性血液病的诊断、分型及病因和发病机制的研究有重要价值，也为遗传咨询、优生优育提供依据。细胞遗传学分析 自从20世纪70年代以来由于染色体分带（一）染色体检查方法 见第十章分子生物学检查中第三节染色体检查。（一）染色体检查方法

23、见第十章分子生物学检（二）染色体分析通常有两个或两以上的细胞分裂相中检出同一条染色体增加或结构异常；有三个或三个以上细胞分裂相中有同一条染色体丢失才能作为一个染色体异常克隆。1、染色体命名人体正常细胞有46条染色体，根据人类细胞遗传学命名的国际体制（ISCN），按其长短和着丝粒的位置编为AG 7组，包括122号常染色体及X和Y性染色体；根据显带特点，将染色体划区分布，一般用4个符号表示特定区带，如“8q22”则代表8号染色体长臂2区2带。 （二）染色体分析通常有两个或两以上的细胞分裂相中检出同一条染（二）染色体分析2、核型分析及书写核型是指中期分裂相的全部染色体按Danvers体制排列而成。其

24、格式书写顺序是：染色体数目、性染色体、染色体异常。各项之间以逗号隔开，性染色体以大写的X与Y表示，各染色变异以小写字母表示，见表5-1。一个完整核型书写方法如下：47，XY，+8，t(9;22)(q34;q11)。表示47条染色体，增加了一条8号染色体，第9号与第22号染色体之间易位，断裂点分别在第9号染色体长臂3区4带和第22号染色体长臂1区1带。 （二）染色体分析2、核型分析及书写（二）染色体分析3、染色体畸变包括数目畸变和结构畸变二类。 正常人体细胞有23对染色体，其中23条来自父方，另23条来自母方，即含有两个染色体组或称为二倍体（2n）。（三）临床常见白血病的染色体改变临床常见白血病

25、的染色体改变见表。（二）染色体分析3、染色体畸变（三）临床常见白血病的染色体改急性髓细胞白血病的MIC分型 核型 FAB形态 MIC建议分型 t(8;21)(q22;q22) M2 M2/ t(8;21) t(15:17)(q22;q11-12) M3，M3v M3/t(15:17) t/del(11)(q23) M5a（M5b,M4） M5a/t(11q) Inv/del(16)(q22) M4Eo M4Eo/inv(16) t(9;22)(q34;q11) M1（M2） M1/t(9;22) t(6;9)(p21-22;q34) M2或M4伴嗜碱粒细胞增多 M2/t(6;9) inv(3)(q21q26) M1(M2、M4、M7)伴血小板增多 M1/inv(3) t(8;16)(p11;p13) M5b伴吞噬细胞增多 M5b/t(8;16) t/del(12)(p12-13) M2伴嗜碱粒细胞增多 M2Baso/t(12p) 急性髓细胞白血病的MIC分型 核型 FAB形态 MIC建议分Ph染色体 是CML的特征性异常染