酶联免疫吸附试验的影响因素课件

1、酶联免疫吸附试验的影响因素 检验科 1酶联免疫吸附试验的影响因素1酶联免疫吸附试验的影响因素 实验过程中的影响因素终止与读数结果的判读试 剂加 样温 育样 本洗 板显 色2酶联免疫吸附试验的影响因素 实验过程中的影响因素终止与读数结果的判读试 剂加 一、标 本 排泄物血 清唾 液尿液、粪便分泌物体 液3酶联免疫吸附试验的影响因素 一、标 本排泄物血 清唾 液尿液、血清标本脂血标本溶血标本标本的保存标本的离心采血试管4酶联免疫吸附试验的影响因素血清标本脂血标本溶血标本标本的保存标本的离心采血试管4酶联免 采血试管 1.使用非抗凝标本（血清）； 肝素抗凝血浆会增加OD值;EDTA、酶抑制剂(如Na

2、N3)可抑制ELISA检测系统中辣根过氧化物酶活性; 2.最好使用一次性玻璃试管或真空采血管.5酶联免疫吸附试验的影响因素 采血试管 5酶联免疫吸附试验的影响因素 标本采集后，应先将标本37放置 30-60分钟后采用3000r /min离心15-20分钟，取 上清液加样。15min 3000r/min标本的离心6酶联免疫吸附试验的影响因素 标本采集后，应先将标本37放置15min 300 标本的离心 强行离心分离血清，会使血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块或附着在酶标板孔壁内使酶标记物不易洗掉，易造成假阳（阴）性结果。7酶联免疫吸附试验的影响因素 标

3、本的离心 7酶联免疫吸附试验的影响因素 标本的保存 1. 一周 - 24 保存； 2. 超过一周 - 建议-20保存。 3. 冰冻血清融解后，蛋白质会出现局部浓 缩而分布不均，加样前应充分混匀。 8酶联免疫吸附试验的影响因素 标本的保存 1. 一周 - 2 标本的保存 4. 混浊或有沉淀的血清标本应先离心或 过滤，澄清后再检测。 5. 作多次检测，宜少量分装冰存; 6. 血清标本宜在新鲜时检测尽量避免细 菌污染。9酶联免疫吸附试验的影响因素 标本的保存9酶联免疫吸附试验的影响因素 避免细菌污染 A.如有细菌污染，菌体中可能含有内源性的 HRP会产生假阳性； B.细菌的生长，其所分泌的一些酶可能

4、会对 抗原抗体等蛋白产生分解作用（如明胶酶 等蛋白水解酶）； C.一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的-半 乳糖苷酶本身会对用相应酶作标记的测定 方法产生非特异性干扰。10酶联免疫吸附试验的影响因素 避免细菌污染10酶联免疫吸附试验的影响因素 溶血标本 1. ELISA以辣根过氧化物酶标记抗原或 抗体； 2. 红细胞破坏后可释放出大量的具有过 氧化物酶活性的血红蛋白； 3. 残留的过氧化物酶催化底物产生非特 性显色导致结果假阳性。11酶联免疫吸附试验的影响因素 溶血标本 1. ELISA以辣根过氧化物酶标记抗原或 脂血标本 1. 脂质小粒粘附在反应孔内壁； 2. 非离子型洗涤剂很难洗掉反应板上干 扰

5、性物质的非特异性吸附，引起吸光 度A值升高，易造成假阳性结果。 餐后抽血、高甘油三脂血症患者、标本离心时间、离心速度不合适等，都可使分离的血清标本中残留着大量的脂质小粒。12酶联免疫吸附试验的影响因素 脂血标本 1. 脂质小粒粘附在反应孔内壁；12酶联免疫吸 二、 试 剂1.试剂盒保存于2-82.使用前应先将检测试剂 盒放置室温平衡15-30 分钟，保证酶等液体的初始反应温度及 活性剂的溶解。3.观察外包装和内组份有无漏液。13酶联免疫吸附试验的影响因素 二、 试 剂13酶联免三、加 样仔细注意加样全部过程移液器的使用及时放入孵育箱标本较多时，请分批操作试剂的滴加14酶联免疫吸附试验的影响因素

6、三、加 样仔细注意加样全部过程移液器的使用及时放入孵育箱标 加样过程应注意： A. 加样不可太快； B. 要避免加在孔壁上部； C. 不可溅出； D. 避免产生气泡； E. 尽可能使用同一加样器，装紧枪 头，加样后充分混匀。15酶联免疫吸附试验的影响因素 加样过程应注意： A. 加样不可太快；15酶联免疫吸附 试剂的滴加 从滴瓶中滴加，应注意滴加的角度和速度。 滴加太快，很容易出现重复滴加或加在两孔之间的现象，这样就会在孔内的非包被区出现非特异吸附，从而引起非特异显色。16酶联免疫吸附试验的影响因素 试剂的滴加 从滴瓶中滴加，应注意滴加17酶联免疫吸附试验的影响因素17酶联免疫吸附试验的影响因

7、素移液器的使用移液的方法及注意事项枪头的装配量程的调节18酶联免疫吸附试验的影响因素移液器的使用移液的方法及注意事项枪头的装配量程的调节18酶联量程的调节 1.从大体积调为小体积 2.从小体积调为大体积 在该过程中，千万不要将按钮旋出量程，否则会卡住内部机械装置而损坏了移液枪19酶联免疫吸附试验的影响因素量程的调节 1.从大体积调为小体积19酶联免疫吸附试验的 枪头（吸液嘴）的装配 使劲地在枪头盒子上敲几下 错误 将移液枪（器）垂直插入枪头中，稍微用力左右微微转动即可使其紧密结合 正确 枪头卡紧的标志是略为超过O型环，并可以看到连接部分形成清晰的密封圈。20酶联免疫吸附试验的影响因素 枪头（吸

8、液嘴）的装配20酶联免疫吸附试验的影响因素 移液的方法前进移液法反向移液法 一般用于转移高粘液体、生物活性液体、易起泡液体或极微量的液体，其原理就是先吸入多于设置量程的液体，转移液体的时候不用吹出残余的液体。重复操作移液法 适用于快速、简便地重复转移等量的同种液体。全血移液法21酶联免疫吸附试验的影响因素 移液的方法前进移液法21酶联免疫吸附试验的影响因素 移液的注意事项 1.吸取液体时，移液器保持竖直状态，将 枪头插入液面下1厘米。 注意吸液体时，一定要缓慢平稳的松开拇指，绝不允许突然松开，以防将溶液吸入过快而冲入移液器内腐蚀柱塞而造成漏气。22酶联免疫吸附试验的影响因素 移液的注意事项22

9、酶联免疫吸附试验的影响因素 移液的注意事项 2.设定加样体积，不能大于加样枪标定的 移液范围 3.加样吸嘴的洁净和装配 4.吸取液体和排出液体动作都一定要慢。 23酶联免疫吸附试验的影响因素 23酶联免疫吸附试验的影响因素 移液的注意事项 5.加样枪严禁吸取有强挥发性、强腐蚀性 的液体（如浓酸、浓碱、有机物等） 6.不要用大量程的加样枪移取小体积的液 体，以免影响准确度。 24酶联免疫吸附试验的影响因素 移液的注意事项24酶联免疫吸附试验的影响因素 移液的注意事项 7.如不使用，要把移液枪的量程调至最大值的刻度，使弹簧处于松弛状态以保护弹簧，并将其竖直挂在移液枪架上。 8.表面清洁：用10%的

10、次氯酸钠溶液或70%的酒精溶液清洁后，自然晾干。 9.微量加样枪必须按要求定期进行校准。25酶联免疫吸附试验的影响因素 25酶联免疫吸附试验的影响因素四、温 育 1. 抗原抗体反应必须在一定的温度条件 下反应一定的时间。2. 温育所需时间与温度成反比。3. 最为常用的温育温度有37和室温， 其次是43和28。26酶联免疫吸附试验的影响因素四、温 育26酶联免疫吸附试验的影响因素 实际操作中应注意： 温育温度的选择足够的反应时间“边缘效应”的排除27酶联免疫吸附试验的影响因素 实际操作中应注意： 温育温度的选择足够的反应时 温育温度的选择 1.微孔板从室温拿至水浴箱或温箱中 时，孔内温度从室温升

11、至37，需要 一定的时间； 2.在临床实验室中，通常是将微孔板一 放入温箱即开始计时，这样就很容易 造成实际测定中温育时间不够，弱阳 性样本测不出来的问题。28酶联免疫吸附试验的影响因素 温育温度的选择 1.微孔板从室温拿至水浴箱或温箱中 “边缘效应”的排除1.“边缘效应”，即外周孔显色较中心孔深;2.有研究证实在温育中的热力学梯度可能是 根本原因。3.聚苯乙烯本身为不良热导体，板从室（通 常在25左右）置于37温箱，板升温 时，在外周孔与中心孔之间可能存在一热 力学梯度。29酶联免疫吸附试验的影响因素 “边缘效应”的排除29酶联免疫吸附试验的影响因素 总而言之，在临床ELISA测定中，要保证

12、好的测定效果，应尽量采用水浴。 温育中让微孔板浮于水面上（浸入1/3），或将浸透水的沙布放入一大饭盒中形成湿盒，然后放于温箱中，这样可使微孔板板孔底部直接与37水或湿布接触，而且水浴箱或湿盒内温度较高，可使反应溶液的温度迅速与温室平衡。30酶联免疫吸附试验的影响因素 30酶联免疫吸附试验的影响因素 五、洗 板 血清中残留的纤维蛋白丝或洗涤液析出的结晶易使洗板机针孔全阻塞或半阻塞，造成未结合标记酶洗脱不彻底，导致“花板”造成假阳性或假阴性。31酶联免疫吸附试验的影响因素 五、洗 板31酶联免疫吸附试验的影响因素32酶联免疫吸附试验的影响因素32酶联免疫吸附试验的影响因素 洗板的注意事项1. 要有

13、适当的浸泡时间（30-60秒）。2. 洗板机吸液要彻底，残余量低于5ul。3. 洗液应调至适当的注出量，每孔应在 350ul-450ul之间，但不要溢出孔外。33酶联免疫吸附试验的影响因素 洗板的注意事项33酶联免疫吸附试验的影响因素4.洗板次数应与说明书要求一致，尽量不 要私自增加或减少洗板次数。5.稀释洗液应使用蒸馏水或去离子水，pH 值不宜过酸或过碱，保证配出的洗液pH 值为7.40.2，水质宜新鲜，长菌或有 沉淀不宜使用，且用非金属容器保存。34酶联免疫吸附试验的影响因素34酶联免疫吸附试验的影响因素6. 由于洗涤液系高浓度磷酸盐，会形成 结晶，配制洗液时应完全溶解。7. 稀释好的洗液

14、4下可保存35天。8. 洗板后，拍干包被板，应垂直扣在备好 的干净吸水纸或毛巾上，且每次拍板应 换掉前次拍过的毛巾或吸水纸，避免交 叉污染。35酶联免疫吸附试验的影响因素6. 由于洗涤液系高浓度磷酸盐，会形成35酶联免疫吸附试验的9. 操作洗板机过程中要不时观察洗板 机针孔内洗液的通畅状况，及时纠 正，洗板机不用时应用去离子水清 洗几遍后关机。10.每周要进行保养清洗。36酶联免疫吸附试验的影响因素9. 操作洗板机过程中要不时观察洗板 36酶联免疫吸附试验的 六、显 色 注意事项：1. 检查底物溶液的有效性；2. 试剂显色时先加A液，后加B液，二者 不要颠倒。3. 前后加入的间隔时间不超过10

15、分钟。37酶联免疫吸附试验的影响因素 六、显 色37酶联免疫吸附试验的影响因4. 若把A液和B液先混合，再加样显色， 需要求二者等体积混合。5. A、B液应避免接触污染物。6. 不同厂家显色液不得混用。38酶联免疫吸附试验的影响因素38酶联免疫吸附试验的影响因素 七、终止和读数 肉眼判断结果时，显色浅不易观察，影响结果的准确性，必须使用酶标仪检测结果，以保证结果一致性。39酶联免疫吸附试验的影响因素 七、终止和读数39酶联免疫吸附试验的影响因素 注意事项1、酶标仪的波长是否合适或滤光片是否正确。2、单波长或双波长比色选择的问题。 ELISA测定比色时，最好是使用双波长比色 3、加完终止液后30

16、分钟内读取数据。4、保证酶标板的底部是清洁干燥的。40酶联免疫吸附试验的影响因素 注意事项40酶联免疫吸附试验的影响因素双波长比色？ 双波长比色测定能排除由微滴板本身、板孔内标本的非特异吸收、指纹、刮痕、灰尘等对特异显色测定吸光度的影响，一般不必设空白孔。 ELISA测定中单个空白孔的非特异吸收上有一定程度的不确定性；在ELISA测定比色时，最好是使用双波长比色。 41酶联免疫吸附试验的影响因素双波长比色？ 双波长比色测定能排除由微滴板本身、八、结果的判读灰区的定义 灰区又称灰色带反应。就是把OD值在Cut off值正负20%这个范围内的标本称为灰区标本。这个范围称为灰区。42酶联免疫吸附试验的影响因素八、结果的判读42酶联免疫吸附试验的影响因素 灰区的处理1.灰区是客观存在的，没有不存在灰区 的试剂，我们只是尽量减少灰区的出 现比例。2.减少灰区最有效的方法就是尽量将板 洗涤干净。3.严格控制温育时间。43酶联免疫吸附试验的影响因素 灰区的处理43酶联免疫吸附试验的影响因素其他的影响 1. 干扰物质的影响 常见的干扰物质如类风湿因子、 甲胎蛋白、某些自身抗体等，都会使 结果造成假阳性。2. 药物的影响 如高效价的乙肝免疫球蛋白等。44酶联免疫吸附试验的影响因素其他的影响44酶联免疫吸附试验的影响因素思考题 为什么多次实验重复性差 （相同样本两次测定结