生化与分生实验课件2电泳技术

1、电泳技术电泳的基本原理带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极移动的现象，称为电泳。带正电荷的粒子向负极移动，带负电荷的粒子向正极移动。是生化与分子生物学的重要研究方法之一，可用于样品分离、物质纯度分析和分子量的测定等。一 .定义带有电荷的生物分子在电场作用下可发生移动。由于混合物各组分所带电荷性质、数量以及分子量各不相同，在同一电场作用下，各组分的泳动方向和速度也各有差异，所以在一定时间内，它们移动距离不同，从而可达到分离鉴定的目的。二.基本原理在一定pH条件下，每一种分子都具有特定的电荷（种类和数量）、大小和形状，在一定时间内它们在相同电场中泳动速度不同，各自集中到特定的位置上而形成紧密

2、的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技术进行分离、分析和鉴定的基本原理。 -+二、迁移率设一带电粒子在电场中所受的力为F，则 F=QE（Q为粒子所带电荷，E为电场强度）根据Stoke定律，一球形分子在溶液中运动所受的阻力F为： F=6rv（v为分子移动速度；r为分子半径；为介质黏度） 当分子达到动态平衡时， F= F 即 QE= 6rv 移项得 v/E=Q/ 6r v/E表示单位电场强度时粒子运动速度，称为迁移率，也称电泳速度，以表示。因此上式也可表示为： =Q / 6r 从上式可得到以下结论带电粒子在电场中的移动与: 粒子大小有关，颗粒直径愈小愈快 粒子的电荷有关，电荷愈多愈快 粒子的形状有关

3、，愈接近球形愈快三、影响迁移速度的因素1.电场强度 电场强度是指每厘米的电位降 凝胶两端距离20厘米，电压降200伏特，电场强度为10伏特/厘米 电场强度越高电泳速度越快2.溶液的PH值 PH值决定带电颗粒的解离程度，决定物质所带净电荷的多少3.溶液的离子强度 缓冲液的离子强度越高，电泳速度越慢 一般在0.02-0.24.电渗现象 在电场中液体对固体支持物的相对移动 纸或纤维素带负电荷，使其接触的水溶液带正电荷，向负极移动。 应尽量避免选用有电渗作用的支持物四、电泳的分类按电泳的原理来分，可分为二类：自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂贵，费

4、时费力，不便于推广应用。区带电泳：是指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用主要是防止电泳过程中的对流和扩散，以使被分离的成分得到最大分辨率的分离。区带电泳由于采用的介质不同以及技术上的差异，又可分为不同的类型。支持物物理性质:滤纸及其他纤维素薄膜电泳、凝胶电泳、粉末电泳、线丝电泳支持物装置形式分类：平板式电泳、垂直板式电泳、连续电泳、圆盘电泳按pH的连续性分类：连续pH电泳、非连续pH电泳琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。其分辨率较高。聚丙

5、烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质琼脂糖凝胶电泳特点1.具有大量微孔2.具有较高的机械强度 可以在1%或更低浓度下使用3.无毒，不需要催化剂4.具有热可逆性，低熔点琼脂糖回收样品容易5.生物中性，与别的生物材料结合性低6.具有高灵敏度放射自显影7.胶凝温度34-43 熔化温度75-90 低熔点琼脂糖胶凝温度低于30 (融化温度高于30 )琼脂糖凝胶配制聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) 聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acry-lamide，简称

6、Acr）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（methylane bisacrylamide，简称Bis）在催化剂作用下合成的。 一、概述CH2=CHC=ONH2CH2=CH C=O NH CH2 NH C=O CH2=CH-CH2-CH-CH2-CH-nCH2-CH- C=O C=O NH2 NH CH2 NH C=O-CH2-CH-CH2-CH-nCH2-CH- C=O C=O NH NH2丙烯酰胺N,N-甲叉双丙烯酰胺聚丙烯酰胺优点 聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，对pH和温度变化小，没有吸附和电渗作用小的特点，是一种很好的电泳支持介质。分类 聚丙烯酰胺凝胶电泳按原理和操作形式的不同，主要有不连