抗生素微生物检定法

1、抗生素微生物检定法第1页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四HPLC紫外分光光度法化学滴定法效价测定第2页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四SH SL TH TL第3页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四前 言 抗生素微生物检定法是国际上通用的、经典的抗生素效价测定方法。自20世纪40年代建立至今，在各国药典中被普遍采用。虽然伴随着HPLC等化学分析技术的发展，一些抗生素品种的效价测定已被化学方法所取代，但由于以下原因：第4页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四前 言微生物检定法可直观、特异地反映出抗生素药品的抗

2、菌活性；多组分抗生素由于不同活性组分生物活性的差异，化学测定结果难以准确表征组分组成、含量和生物活性间的关系；许多抗生素品种由于各种原因目前没有适当的化学分析方法表征其活性。 所以抗生素微生物检定法目前在各国药典中仍占有重要地位，且短期内化学分析法不可能取代微生物检定法。第5页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四1定义抗生素微生物检定法抗生素微生物检定法是利用抗生素在低微浓度下有选择地抑制或杀死微生物的特点，以抗生素的抗菌活性为指标，来衡量抗生素中的有效成分效力的方法。第6页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四1定义抗生素青霉素 “抗生素是微生物在代谢中

3、产生的具有抑制它种微生物生长活动、甚至杀灭他种微生物的化学物质”。“是在低微浓度即可对某些生物的生命活性有特异抑制作用的微生物次级代谢产物及其衍生物 ”“抗生素是生物（包括微生物、植物、动物在内）在其生命活动中产生的（或并用化学、生物或生化方法衍生的），能在低微浓度下有选择地抑制或影响它种生物机能的化学物质的总称。” 由生物发酵改为化学合成（氯霉素）、全新结构的全合成抗生素（氨曲南）抗肿瘤、抗寄生虫等抗生素的不断发现 、化学改造推动半合成抗生素的迅速发展 定义为1942年，链霉素的发现者Waksman定义：1929 年Flemming发现第一种抗生素（ ）第7页，共134页，2022年，5月2

4、0日，0点21分，星期四1.定义抗菌活性抗菌活性是指抗菌药物抑制或杀死病原微生物的能力。 抗生素的抗菌活性通常用效价单位来表示。在临床应用中，抗生素的抗菌活性可准确地反映抗生素的医疗价值。 硫酸链霉素 798单位/毫克青霉素G钠 1670单位/毫克杆菌肽 74单位/毫克第8页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四1.定义抗生素效价定义“活性”重量单位重量折算单位特定单位第9页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四1.定义抗生素效价定义“活性”重量单位：以抗生素中所含特定的抗菌（抗肿瘤细胞、抗病毒）活性部分的重量作为效价单位。如碱性抗生素，以纯碱的量作为有效部

5、分的量；酸性抗生素，以纯酸的量作为有效部分的量。第10页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四1.定义抗生素效价定义在抗生素的生产、研究和应用等方面，均以抗生素活性成分的“活性”重量计量抗生素的效价单位，采用活性成分的“活性”重量1g1效价单位的方法表示。抗生素效价以“单位（u）”或“微克（g ）”表示。 第11页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四1.定义抗生素效价定义例：硫酸链霉素抗菌活性是以链霉素效价单位表示的，其链霉素的效价单位是以具活性成分链霉素碱的“活性”重量表示的，即1链霉素效价单位1微克链霉素碱，这里是“活性微克”而不是“重量微克”。第12

6、页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四1.定义抗生素效价定义在制成盐类或其他衍生物后，其相应的折算效价，可以从分子量折算而得。如：硫酸链霉素的折算效价为第13页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四1.定义抗生素效价定义重量折算单位：以特定的纯抗生素制品的某一重量为1单位而加以折算。如：青霉素G钠 以青霉素单位也称牛津单位（Oxford unit）表示其抗菌活性，最初的定义为“1个青霉素效价单位（u）为能在50毫升肉汤培养基中完全抑制金黄色葡萄球菌标准菌株发育的最小青霉素剂量”。第14页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四1.定义抗生素

7、效价定义例：青霉素国际标准品第一批青霉素国际标准品，青霉素G钠称重0.6微克为1单位，即1667单位/毫克。第二批青霉素国际标准品，青霉素G钠称重0.5988微克为1单位，即1670单位/毫克。第15页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四1.定义抗生素效价定义特定单位：这一类抗生素大都组成成分较复杂，或还不易得到纯品，在开始生产及临床使用时，只能以一特定量的标准品（或对照品）作为1单位。如：杆菌肽国际标准品 第一批杆菌肽国际标准品为55单位/毫克； 第二批杆菌肽国际标准品为74单位/毫克。第16页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四1.定义抗生素微生物检

8、定法抗生素微生物检定法可分为： （1）稀释法 （2）比浊法 （3）琼脂扩散法（管碟法和打孔法）各国药典通常采用后两种方法测定抗生素的效价。第17页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四1.定义稀释法通过监测等量的试验菌菌液在不同浓度的抗生素液体培养基中的生长情况，观察含不同浓度抗生素的液体培养基中有无细菌的生长，从而测定抗生素最低抑菌浓度（MIC）的方法，常用于新药研制及临床药敏试验等方面。 第18页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四1 2 3 4 5 6 7 8 一 一 一 一 一 一 一 一 不同浓度的 抗生素液体培养基 浓 稀等量的试验菌菌液第19

9、页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四1.定义比浊法通过监测等量的试验菌菌液在不同浓度的抗生素液体培养基中的生长情况，利用分光光度法测定含不同浓度的抗生素的液体培养基的浊度，从而衡量抗生素抑菌效力的方法，可用于抗生素药物的含量（效价）测定。 第20页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四1.定义（琼脂）扩散法通过测定由不同浓度的抗生素溶液在含有试验菌固体培养基中的扩散，而在其表面所产生的抑菌圈的大小，衡量抗生素抑菌效力的方法，多用于抗生素药物的含量（效价）测定。第21页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四抗生素微生物检定方法比较： 第2

10、2页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四1.定义管碟法 此法系根据抗生素在一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径（面积）呈直线关系而设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品的效价。 TH TL SH SL第23页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四2.原理抑菌圈的形成两种互动作用：一种是抗生素溶液向培养基内呈球面状扩散作用；另一种是试验菌的生长作用。当培养到一定时间，琼脂培养基中的两种互动作用达到动态平衡时，琼脂培养基中便形成透明的抑菌圈。即：在抑菌圈中因抗生素浓度高于抑菌浓度，试验菌生长受到抑制，此处琼脂培

11、养基成透明状；在抑菌圈边缘抗生素浓度恰好等于抗生素最低抑菌浓度。第24页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四2.原理量反应平行线原理量反应平行线原理：“在属量反应的指标中，当对数剂量和反应呈直线关系，且供试品和标准品的作用性质相同时，供试品和标准品的两条对数剂量和反应关系直线相互平行”。第25页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四2.原理量反应平行线原理在抗生素微生物检定法中，一定剂量范围内，抗生素对数剂量与其所致抑菌圈的大小呈直线关系。这就在理论上决定了，（活性）成分相同的标准品与供试品在一定剂量范围内产生的两条剂量反应直线相互平行，符合量反应平行线原

12、理的基本要求。第26页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四2.原理量反应直线两位微生物学者Hamphrey Light和Brown推导出的琼脂球面扩散动力学公式：该方程奠定了管碟法量反应直线公式的基础。第27页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四将上述公式简化、移行，并将自然对数转换为常用对数得：上述公式表明，抗生素总量的对数(lgM)与所形成的抑菌圈半径的平方(r2)呈直线关系，即通过抑菌圈的大小来测定抗生素抗菌活性物质的量。 第28页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四3.检定方法分类一剂量法（标准曲线法）二剂量法（2 2法）三剂

13、量法（3 3法）第29页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四二剂量法（2 2法）：用标准品、供试品各两个剂量，根据量反应平行线原理，在相同试验条件下，比较标准品和供试品二者对微生物产生的效力。二剂量法用于抗生素药品效价的常规测定；3.1管碟法的操作步骤第30页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四3.1管碟法的操作步骤 预试验试验准备 双碟底层的制备 供试品、标准品溶液的制备菌层的制备滴加抗生素溶液双碟的培养 抑菌圈的测量结果的可靠性检验及效价测定第31页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四3.1管碟法的操作步骤预试验： 确定最佳的试验

14、条件：调整试验菌的浓度、使用量、抗生素终浓度、培养基等，使抑菌圈的大小符合规定：高剂量浓度溶液所致的抑菌圈直径在1822mm。高剂量与低剂量的抑菌圈直径之差最好不小于2mm。高低剂量之比为2:1（如高、低剂量所致的抑菌圈差别较小时，可用4:1的剂量比率）。第32页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四3.1管碟法的操作步骤试验准备： 双碟、钢管、毛细滴管、吸管的清洗及灭菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培养基、缓冲液的准备、半无菌间的紫外消毒等。第33页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四3.1管碟法的操作步骤双碟底层的制备： 每只双碟加底层培养基约20ml，待

15、培养基凝固，待用。第34页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四3.1管碟法的操作步骤供试品、标准品溶液的制备： 估计供试品的效价，根据试验要求设计供试品、标准品溶液稀释步骤，平行制备供试品、标准品相关剂量的溶液。第35页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四3.1管碟法的操作步骤菌层的制备： 菌层培养基：在培养基中添加一定量的菌悬液，振摇混匀。注意菌层培养基温度；根据预试验确定加入菌层培养基的菌液量。 每只双碟加入5ml菌层培养基。 注意制备菌层的速度和平整度。第36页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四3.1管碟法的操作步骤滴加抗生素

16、溶液：注意标准品、供试品高、低剂量溶液滴加顺序，保证滴加速度和加量的均匀一致。每组双碟至少为8个，一般为10个。在每个双碟的4个钢管中，对角的两个钢管分别滴加高浓度和低浓度的标准品溶液，其余两个对角位置的钢管分别滴加相应的高、低浓度的供试品溶液。按SHTHSLTL顺序，分别滴加标准品和供试品高、低剂量溶液。第37页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四3.1管碟法的操作步骤双碟的培养： 根据培养温度的要求在培养箱中进行培养，培养箱中水平叠放的双碟数以不超过三层为宜。第38页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四3.1管碟法的操作步骤抑菌圈的测量： 将培养好的

17、双碟取出，打开陶瓦盖，将钢管倒入1：1000新洁尔灭溶液或其他消毒液内浸泡，检查抑菌圈是否圆整，如有破圈或不圆整圈应将碟弃去，切忌主观挑选抑菌圈和双碟，是结果造成偏离。 抑菌圈测量仪的使用：每组试验双碟应在相同的测量参数下进行测量。 手工测量：游标卡尺第39页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四3.1管碟法的操作步骤结果的可靠性检验及效价测定： 抑菌圈测量仪提供计算结果或手工计算结果。第40页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四3.1管碟法的操作步骤培养后的双碟第41页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四3.1结果计算及判断可靠性检验

18、抗生素微生物检定法前提条件是：标准品S和供试品T各对数剂量与反应呈直线关系，且标准品S和供试品T的两条直线平行。可靠性测验是利用生物统计方法验证标准品和供试品的量反应关系是否显著偏离直线、偏离平行。对在一定概率水平下不显著偏离直线、不显著偏离平行的实验结果，认为可靠，所得检定结果有意义。 第42页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四3.1结果计算及判断以红霉素眼膏为例，红霉素标示量为0.5%，即每1g红霉素眼膏中含5000u红霉素。假设投料量为100%，那么估计效价为100%。试验采用二剂量法；剂间比为2；浓度比为1；试验菌为短小芽孢杆菌CMCC（B）63 202。 第43

19、页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四3.1结果计算及判断可靠性测验计算：结论：回归非常显著F27.82（P0.01）(即不显著偏离直线）；偏离平行不显著F34.26（P0.05）；实验结果成立。试品间 F1= 0.5326 P=0.05 F= 4.2600 回 归 F2= 873.2370 P=0.01 F= 7.8200 偏离平行F3= 0.2537 P=0.05 F= 4.2600 P0.05 剂 间 F6= 291.3411 P=0.01 F= 4.7200 碟 间 F7= 2.1653 P=0.01 F= 3.6700 回归（F2）表示测验的量反应值是否随剂量而有

20、规律的增加或降低。回归项变异（P0.05）不显著，则平行关系是可靠的。第44页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四3.1结果计算及判断抑菌圈测量值： = 碟号 ds1 ds2 dt1 dt2 ym- No.1 18.13 19.24 18.09 19.63 75.09 No.2 17.85 19.41 17.96 19.60 74.82 No.3 18.14 19.55 18.09 19.89 75.67 No.4 18.05 19.83 18.10 19.75 75.73 No.5 18.07 19.98 18.21 19.70 75.96 No.6 18.15 19.3

21、7 17.88 19.52 74.92 No.7 18.19 19.46 17.97 19.63 75.25 No.8 17.93 19.85 18.06 19.94 75.78 No.9 18.09 20.04 18.35 19.67 76.15- yk 162.60 176.73 162.71 177.33 679.37-第45页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四3.1结果计算及判断效价计算：碟数 m= 9 圈数 K= 4 估计效价 At=100%剂间比 r= 2.0000 浓度比 D= 1.0000 对数值 I= 0.3010t表 t= 2.0640 样品方差 S2

22、= 0.0263 自由度 f=24R的对数 M= 0.0074 回归系数 g= 0.0049 标准误差 Sm= 0.0102对数比值 R= 1.0173 R上限 Rh= 1.0680 R下限 Rl= 0.9691测定效价 Pt=101.7265% Pt上限 Ph=1067.9584 下限 Pl= 969.1406平均可信限率Pt的FL%=4.86%PT的可信限FL和平均可信限率FL% 可信限FL和平均可信限率FL%是反映检定结果精密度的统计量。PT的可信限是PT标准误差SM和t值（在95%的概率水平下）的乘积。可信限范围（PT tSM）表示对该供试品进行100次检验，95次的结果在PTtSM

23、PTtSM范围里。PT平均可信限率FL%： FL%= (tSM)/PT 100% 中国药典中，一般抗生素微生物检定平均可信限率限定在5%范围内，个别品种放宽至7%。 第46页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四3.1结果计算及判断重试判定抑菌圈大小的要求可靠性检验： 符合可靠性检验各项规定后，才能认为试验结果可靠，方可进行效价和可信限率计算。可信限率： 供试品效价测定结果（PT）的可信限率除特殊规定外，不得大于5%。 实测效价与估计效价： 试验计算所得效价应在估计效价的10%以内，即：试验所得效价低于估计效价的90%或高于估计效价的110%，则检验结果仅作为初试，应调整供试

24、品估计效价，予以重试。效价测定结果不符合规定时，需换人加倍复试。 第47页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四标准曲线法（一剂量法）： 将标准品一组剂量的对数与微生物的反应绘制成直线图，相同条件下，测得供试品对微生物的反应值，在标准品的标准曲线上查出引起该反应的抗生素的相对浓度及效力。一剂量法一般用于制备标准曲线或测定血药浓度。 3.2一剂量法第48页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四操作步骤标准曲线法中心点浓度C0的选取中心点的抑菌圈直径应在1617.5mm。剂距按等比级数选取。一般采用1:0.8、1:0.88、1:0.85。C0C0C0CCC第49

25、页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四操作步骤标准曲线法分组按选取的C0及剂距，一般分为8个组，即溶液浓度为C1、C2C8。每组双碟数应不少于3个，一般可用5个，个别情况可增至10个。C0C0C0CCC第50页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四操作步骤标准曲线法点样每个双碟安置6枚钢管。在各组每个双碟6枚钢管相间隔的三个钢管内，均滴加C0标准液。在第一组每个双碟的其余三个钢管内滴加C1的溶液，在第二组每个双碟的其余三个钢管内滴加C2的溶液滴加药液的顺序，可从中心浓度组开始向高、低两端交叉滴加。如8个稀释度的双碟，滴加次序可为C4、C5、C3、C6、C2

26、、C7、C1及C8。C0C0C0CCC第51页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四操作步骤标准曲线法抑菌圈的测量双碟在规定温度下培养一定时间后，采用抑菌圈测量仪测量每组试验双碟抑菌圈的直径。结果计算及可靠性检验以抑菌圈直径为横坐标，以浓度的对数为纵坐标，绘制标准曲线。经计算得到回归直线方程相关系数：1r0.99第52页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四3.3检定方法三剂量法（3 3法）：用标准品、供试品各三个剂量，根据量反应平行线原理，在相同试验条件下，比较标准品和供试品二者对微生物产生的效力。三剂量法用于抗生素药品的仲裁或标准品的标定 。第53页，共

27、134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四操作步骤三剂量法基本要点中剂量点的抑菌圈直径应在1518mm。三个剂量之比为1:0.8（1.25:1）。点样每组双碟至少为9个，一般为15个。在每个双碟的6个钢管中，互相间隔的3个钢管分别滴加高、中、低浓度的标准品溶液，其余3个钢管内分别滴加相应的高、中、低浓度的供试品溶液。按SHTHSMTMSLTL或THSHTMSMTLSL顺序，分别滴加标准品和供试品高、中、低剂量溶液。第54页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四操作步骤三剂量法三剂量法双碟、钢管与抑菌圈位置图S3：标准品高剂量 S2：标准品中剂量 S1：标准品低剂量T

28、3：供试品高剂量 T2：供试品中剂量 T1：供试品低剂量第55页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四操作步骤三剂量法抑菌圈的测量双碟在规定温度下培养一定时间后，采用抑菌圈测量仪测量每组试验双碟抑菌圈的直径。结果计算及可靠性检验第56页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四4.实例及操作要点硫酸庆大霉素第57页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四中国药典硫酸庆大霉素二剂量法实验条件培养基：培养基I（pH7.88.0）试验菌：短小芽孢杆菌CMCC(B)63 202第58页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四中国药典硫酸庆

29、大霉素二剂量法实验条件缓冲液：pH7.8磷酸盐缓冲液取磷酸氢二钾5.59g与磷酸二氢钾0.41g，加水使成1000ml，滤过，在115灭菌30分钟。 K2HPO43H2O5.59/174.18（174.18+3 18）=7.32第59页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四中国药典硫酸庆大霉素二剂量法实验条件双碟的制备：将双碟置于水平面上，加底层培养基20ml，待凝固后，加菌层培养基5ml，凝固后备用。菌层培养基中菌悬液的量约为培养基量的2%。加菌悬液的量可视抑菌圈大小及清晰程度进行调节。第60页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四称样量的计算按标准品的标

30、识效价、供试品的标识量或估计效价计算称样量：第61页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四中国药典硫酸庆大霉素二剂量法操作步骤：标准品溶液的制备：假设：硫酸庆大霉素标准品的效价为636单位/mg，理论计算应精密称取78.62mg，置50ml量瓶（636单位/mg78.62mg50000单位）中，恰好为1000单位，但实际操作中一般称量数接近即可，如精密称取标准品80.10mg。第62页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四中国药典硫酸庆大霉素二剂量法操作步骤：80.10mg 水 50ml 制成1018.87单位/ml精密量取5ml buffer 50ml 制

31、成101.887单位/ml精密量取5ml buffer 50ml 制成10.189单位/ml精密量取5ml buffer 100ml 制成5.094单位/ml庆大霉素 212单位/ml第63页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四中国药典硫酸庆大霉素二剂量法操作步骤：供试品溶液的制备（原料）： 根据硫酸庆大霉素原料的估计效价计算供试品的称样量。假设：供试品的估计效价为590单位/mg，则称样量为50000/590=84.74mg，但实际取样量为84.24mg，第一步称样置50ml量瓶中，实际估计效价为80.10mg636u/mg/84.24mg604.7436单位/mg。 第

32、64页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四中国药典硫酸庆大霉素二剂量法操作步骤：84.24mg 水 50ml 精密量取5ml buffer 50ml 精密量取5ml buffer 50ml 精密量取5ml buffer 100ml第65页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四中国药典硫酸庆大霉素二剂量法操作步骤：供试品溶液的制备（制剂）片剂：取本品10片，精密称定，研细，精密称取适量（根据平均片重及标示量折算，约相当于庆大霉素0.1g）,如为糖衣片，取5片，全部研细，加灭菌水振摇使硫酸庆大霉素溶解，并稀释成每1ml中约含1000单位的悬浮液，摇匀，静置，取

33、上清液适量，照硫酸庆大霉素项下测定方法测定。第66页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四中国药典硫酸庆大霉素二剂量法操作步骤：平均片重为0.1357g规格为40mg(4万单位)暂估计其标示量为95%第一步需制成1000单位/ml溶液，拟取供试品10万单位为：1000000.1357g/(4000095%)=0.3618g，实际称取0.3702g，则实际估计标示量为：第67页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四中国药典硫酸庆大霉素二剂量法操作步骤：用钢管放置器或适宜方法等距离均匀放置不锈钢小管，并静置510分钟，使钢管在琼脂内稍下沉稳定后，再滴加抗生素溶液

34、。 每次以5个双碟为一“小分队”滴加药液。滴加溶液：按SHTHSLTL顺序，分别滴加标准品和供试品高、低剂量溶液。可以使高低剂量的抑菌圈直径差异显著，从而提高检定灵敏度。培养温度和时间：培养温度为3537，培养时间为1416h。结果计算：测定抑菌圈，进行可靠性检验，计算效价，可靠性检查若能通过，且可信限率不超过7%，则试验数据有效。如果所测得的效价结果低于估计效价的90%或高于110%时，则检验结果只作为初试，应调整供试品估计效价，重新试验。第68页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四平均可信限率不大于7%的品种红霉素、琥乙红霉素、依托红霉素克拉霉素硫酸西索米星硫酸奈替米星

35、硫酸依替米星硫酸庆大霉素硫酸小诺霉素第69页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四操作要点第一步一般应制成500或1000单位/毫升的溶液，以后逐步稀释至供试浓度的溶液，每步稀释的量取量以不少于2ml为宜，稀释步骤应少于3步。溶解：对于需用乙醇溶解的样品，由于溶解样品时所用乙醇量较大，加灭菌水后溶液放热，因此需充分摇匀后加灭菌水至接近容量瓶刻度，待冷至室温后再稀释至刻度。第70页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四操作要点培养基的pH值，对试验结果影响很大，使用时培养基的pH值应调节到适合该品种试验的最佳范围。通常灭菌后的pH值范围为7.88.0或6.56

36、.6。对碱性抗生素而言，在偏碱性条件下它的抗菌活力强，如氨基糖苷类的链霉素在pH值7.8以上时活力强，抑菌圈清晰，当抑菌圈偏小时，可考虑把培养基的pH值适当调高至8.0或更高些。对酸性或两性抗生素，在酸性条件下它的抗菌作用强，使用pH值6.56.6培养基为合适。通常灭菌后pH值会下降0.2左右，因此pH值应略高0.20.4。调节时要注意逐渐加碱，防止过量，否则再加盐酸矫正，将会增加培养基的含盐量，从而降低培养基的使用效果。 第71页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四操作要点 试验菌的菌龄对抑菌圈有一定影响。故检定时应保持菌种及菌液的新鲜。一般菌种一月转种一次，冰箱冷藏保存

37、。对易变异的菌株，如藤黄微球菌等在制备菌悬液前进行单菌分离；其他菌株可半年分离一次。试验菌传代最好不超过5次，以防止菌种老化变异。芽孢杆菌培养物用灭菌水洗下后，应在65加热30分钟，使菌体的菌龄一致，用革兰氏染色，应有芽孢85%以上。第72页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四操作要点加入菌悬液的体积，一般不少于0.3ml，并且不大于上层培养基体积的2%。如果加入菌悬液的体积过小，则在同样实验中，不同次加入菌悬液的体积相差较大，造成实验误差；如果加入菌悬液的体积过大，则会使上层培养基变稀，并且因菌悬液的温度较低，加至培养基中可能造成培养基结块，影响测定结果。对于加入菌悬液体

38、积的控制，可通过调节菌悬液的浓度来实现。第73页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四操作要点在制备菌层培养基时，将菌液加入菌层培养基后，立即充分摇匀，但应避免产生气泡。加入芽孢悬液时，菌层培养基的温度为65，对非芽孢悬液时，菌层培养基的温度一般为4850。放置孵箱培养时排放应不得超过三层，避免因培养温度不均匀而导致各双碟中抑菌圈大小不一。第74页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四5.检定的影响因素标准品与供试品的同质性抑菌圈质量的控制直线斜率的控制直线截距的控制第75页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四5. 影响因素标准品与供试品

39、同质抗生素效价测定方法依据的原理是量反应平行线原理，即标准品与供试品剂量的反应直线是相互平行的。如不平行，则斜率不等，计算结果将产生较大的误差。第76页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四5. 影响因素标准品与供试品同质多组分抗生素标准品所含的抗菌活性物质或影响抗菌活性（增强或拮抗）物质的量与供试品有所不同，则可使量反应直线不平行。用于标准品、供试品溶液制备的缓冲溶液pH、盐浓度不相同。 供试品中所含有的如维生素、氨基酸、无机盐或其他生长物质，而标准品中没有，在营养条件低的培养基上即会产生影响。某些对光敏感的多烯类抗生素在标准品、供试品溶液配制，及试验过程中应注意避免光线直

40、射。有差向异构特性的抗生素在测定时，尤其注意pH、盐浓度、温度和光照对抗生素差向化的影响，保证标准品与供试品在相同条件下进行测定，以消除影响。（如四环素在1mol/L磷酸盐或枸橼酸盐缓冲液中，pH3.2（23）时可形成55%差向四环素异构体，它的活性相当于四环素的5%，造成二者反应直线不平行）第77页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四5. 影响因素标准品与供试品同质 “乙酰吉他霉素”是以“吉他霉素”来表征其抗菌活性的，日抗基有收载，效价测定时以“吉他霉素”为标准品，将“乙酰吉他霉素”水解24小时后再进行测定。在测定时曾发现测定结果的误差较大，重现性差。采用HPLC法对乙酰

41、吉他霉素水解后的组分进行测定，以考察其是否水解为吉他霉素。第78页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四乙酰吉他霉素乙酰吉他霉素水解24小时吉他霉素组分第79页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四结果显示，乙酰吉他霉素经24小时水解后并未转变为吉他霉素，并与乙酰吉他霉素的成分也不同，提示采用吉他霉素为标准品测定乙酰吉他霉素效价时，吉他霉素标准品与乙酰吉他霉素水解后的样品的成分不同，易引起实验误差。根据量反应平行线原理，标准品与供试品的同质性，改用乙酰吉他霉素为标准品，将标准品与供试品同时水解后测定，减小了误差。第80页，共134页，2022年，5月20日，

42、0点21分，星期四水解条件的修订琥乙红霉素水解条件由： （CP2000） （CP2005）依托红霉素（CP2000） （CP2005） （CP2010）室温2h室温16h或406h室温2h376h604h第81页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四5.影响因素抑菌圈质量的控制抑菌圈的形状抑菌圈大小的控制抑菌圈边缘清晰度的控制第82页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四5.影响因素抑菌圈质量的控制抑菌圈的形状：实验中抑菌圈常多有破裂、不圆、甚至无圈的现象，其原因是多方面的：在滴加抗生素溶液时药液溅出、毛细滴管碰到钢管壁使抗生素溶液漏出，抑菌圈出现不圆；双碟

43、、钢管、钢管放置器内有残留抗生素污染（如庆大霉素、平阳霉素等容易吸附在钢管、玻璃仪器的表面），出现细菌不生长，或者有多余的抑菌圈产生，或者抑菌圈非正常的变大；试验菌菌龄过老、菌层培养基加菌液时培养基温度过高，将检定菌烫死等，会导致细菌不生长；稀释抗生素溶液所用缓冲液的pH值和盐浓度也可影响抑菌圈的圆整，如氨基糖苷类抗生素，当缓冲液的pH值偏低、盐浓度偏高时，会出现无抑菌圈或呈向心形、椭圆形抑菌圈。 第83页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四5.影响因素抑菌圈质量的控制抑菌圈大小的控制 M=C0V 当抗生素浓度C0不变时，体积V（即加样量）的对数与抑菌圈直径或面积呈直线关系

44、，故钢管中滴加抗生素的体积应一致。钢管（截面积A，高度L）的大小（重量、直径、高度）应严格控制。 第84页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四5.影响因素抑菌圈质量的控制抑菌圈大小的控制 抑菌圈大小受T值（抗生素扩散时间，即细菌刚生长到显示抑菌圈所需的时间）增减的影响，故预先延长抗生素的扩散时间可使抑菌圈变大。 第85页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四操作中若各钢管中加液时间不同，差值为t，则T变成T t，此时可影响抑菌圈的大小不均一，所以一组双碟加样时，应尽量缩短加样间隔时间，并保持加样速度的均匀性，以减少误差。 抑菌圈的大小还受抗生素扩散系数D的

45、影响，若在缓冲液中加入0.3%的氯化钠或在培养基中加一定量的盐或吐温，可增加抗生素的扩散能力，使抑菌圈增大。 第86页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四5.影响因素抑菌圈质量的控制抑菌圈边缘清晰度的控制 抑菌圈边缘清晰度是影响测定结果的重要因素之一，导致抑菌圈边缘不清晰的原因有多种：在抑菌圈形成过程中抗生素的扩散系数紊乱、不均一，不符合动力学公式中各项之间的关系或各扩散系统交叉所致。如试验菌种放置时间过长，菌群中个体的生长周期不同，对抗生素的敏感度不同，往往使抑菌圈形成双圈或多圈，使边缘模糊不清。 培养基原材料的成分及质量、pH值、盐浓度及培养时间均可影响抑菌圈边缘的清晰

46、度。多组分抗生素中，各组分抗菌活性的不同，扩散系数也不同，其交叉作用影响抑菌圈边缘的清晰度。 第87页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四5.影响因素斜率的控制由公式中斜率（ ） 来推算： 反应直线的斜率愈小愈好，因为斜率越小，直线越平稳，抗生素效价的微弱差别，可导致抑菌圈大小的差别较大，使测定结果更精确。如扩散快，即扩散系数D值大，则斜率小；如细菌生长慢，时间长，T值大，则斜率小。如扩散系数D值不变，T值变小，则试验菌生长快，时间短，斜率就大，这样生物反应的灵敏度低，重现性差。为使T值增大，可在滴加药液后，在室温放置约1小时，再置孵箱培养。 第88页，共134页，2022

47、年，5月20日，0点21分，星期四5.影响因素直线截距的影响相同浓度的抗生素，截距小的抑菌圈大，效价测定的灵敏度高。 截距的大小取决于 数值，除温度、扩散系数和抗生素最低抑菌浓度对截距有影响外，培养基厚度H也是影响因素之一。培养基厚度越薄，截距减小，抑菌圈增大，所以在制备双碟时，应保持在相同的试验组内，每只双碟中底层和菌层培养基的厚度应保持一致性和均匀性。 第89页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四管碟法特点 优点：基本操作和设计适用于各种抗生素，试验结果较稳定；样品用量少，灵敏度高；适合于大批样品的测定。第90页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四管

48、碟法特点缺点:凡具有抗菌活性的物质都会干扰测定结果；试验过程长，需第二天才有结果；操作手工化，需熟练人员才能得到较正确的结果；受扩散因素的影响，如培养基原材料的质量，一般琼脂中的杂质可能影响扩散速度及效价强度。第91页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四0个（cp2000) 1个（cp2005）22个（cp2010)比浊法第92页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四比浊法定义基本原理应用举例操作步骤注意事项检定的影响因素比浊法的特点和仪器第93页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四1.比浊法的定义中国药典2005年版的定义： 本法系利

49、用抗生素在液体培养基中对 试验菌生长的抑制作用，通过测定培养后细菌浊度值的大小，比较标准品与供试品对试验菌生长抑制的程度，以测定供试品效价的一种方法。第94页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四2.检定原理基本原理：细菌接种于澄清的营养丰富的液体培养基中，在一定的温度下培养一段时间，变浑浊，其浑浊程度与细菌数的增加、细菌群体质量的增加和细菌群体细胞容积的增大之间存在着直接的关系。当一定的光束照射其已经浑浊的液体培养基时，通过测定其透过率就知道细菌生长情况，在一定的抗生素浓度范围内，剂量响应为一直线。因此，在剂量响应曲线的直线范围内，可设计比浊法测定抗生素含量。第95页，共1

50、34页，2022年，5月20日，0点21分，星期四2.检定原理细菌的群体生长期的选择： 细菌的群体生长的整个变化过程大致可划分为如下阶段或时期：（A）诱导期（延滞期）（B）对数生长期（C）稳定期（D）死亡期第96页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四2.检定原理(A)诱导期（延滞期）： 本阶段为增殖准备期，细胞处于适应时期，本阶 段时间的长短受多种因素的影响。当培养基营养 丰富，新鲜，培养条件适宜，接种的培养物又具 有很强的活力时，时间将会缩短，反之，则时间延长。本阶段内各种酶合成旺盛，体积增大。(B)对数生长期： 在诱导期后，细胞经过适应、恢复，在提供足够的营养物质条件下

51、，细胞数呈对数生长速率，此时，细菌细胞数的增长率是细胞数、基质的浓度与抑菌物质浓度三者的函数。在对数生长期中细胞数的增长率一般是一个常数。第97页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四2.检定原理（C）稳定期： 本阶段细胞增长率逐步下降到零，一部分 细胞繁殖、生长，另一部分细胞死亡，趋 于平衡。 （D）死亡期： 细菌细胞的死亡率超过增长率，细胞总数开始减少，主要是营养物质的缺乏、代谢产物的毒性、自溶酶的产生而导致细菌细胞溶解或死亡。第98页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四2.检定原理测定时间的选择剂量反应平稳生长时间段： 一定抗生素浓度范围内，检定菌在

52、单位时间内的生长速度相同，即生长速率相同，也就是在一段时间内反应培养时间(A-t)呈显著的直线关系，且在不同抗生素浓度下的生长速率也相同。第99页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四3.应用举例第100页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四中国药典2005版比浊法品种：硫酸庆大霉素的效价测定 抗生素试验菌培养基灭菌缓冲液pH值抗生素浓度范围单位/ml培养类别条件编号pH值温度/庆大霉素金黄色葡萄球CMCC(B)26003III7.07.27.80.151.03537第101页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四中国药典2005年版硫酸

53、庆大霉素的效价测定：（1）试验菌液的配制：取金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在3537培养2022小时后，用0.9%灭菌氯化钠溶液洗下菌苔，并用0.9%灭菌氯化钠溶液稀释，使其在650nm波长处的吸收值为1.0。（2）含试验菌的液体培养基配制：取试验菌液1.5ml置100mlpH7.07.2培养基III中，摇匀，备用。临用前，取规定的试验菌悬液适量（ 3537培养34小时后测定的吸光度在0.3 0.7之间，且剂距为2的相邻剂量间的吸光度差值不小于0.1），加入到各规定的液体培养基中，混合。使在实验条件下能得到满意的剂量-反应关系和适宜的测定浊度

54、。已接试验菌的液体培养基应立即使用。第102页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四中国药典2005年版硫酸庆大霉素的效价测定：（3）缓冲液：pH7.8磷酸盐缓冲液第103页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四中国药典2005年版硫酸庆大霉素的效价测定：阳性对照：取1支试管，加入灭菌水1.0ml，再加入含试验菌的液体培养基9.0ml。阴性对照（空白对照）：取1支试管，加入灭菌水1.0ml，再加入含试验菌的液体培养基9.0ml，立即加入甲醛溶液0.5ml，混匀，作为吸光度测定的空白液。第104页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四中国药典

55、2005年版硫酸庆大霉素的效价测定：（4）效价测定：供试品溶液的配制：取庆大霉素制剂适量，精密称定，按标示量用灭菌水制成1000u/ml的溶液，精密量取溶液适量，用pH7.8磷酸盐缓冲液稀释成0.4和0.8u/ml(1:2)的溶液。标准品溶液的配制：取庆大霉素标准品适量，精密称定，用灭菌水制成1000u/ml的溶液，精密量取溶液适量，用pH7.8磷酸盐缓冲液稀释成0.4和0.8u/ml(1:2)的溶液。分别精密量取高低剂量的供试品溶液和对照品溶液各1.0ml，置灭菌试管中，每个浓度6管，分别加入实验培养基9.0ml，立即摇匀，置37水浴培养34小时，取出，立即加入甲醛溶液，摇匀，照分光光度法，

56、在530nm波长处测定吸收值，照生物检定统计法（附录XIV）中的2.2法计算，同时与管碟法进行了比较，结果如下： 第105页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四测定结果的比较第106页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四4.比浊法的操作步骤： 预试验试验准备供试品、标准品溶液的制备 菌液培养基的制备加抗生素溶液 比色管的培养菌浓度的测量 结果的可靠性检验及效价测定第107页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四4.比浊法的操作步骤预试验： 确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、使用量、抗生素终浓度、培养基等，使高、低剂量浓度标准品溶液所

57、致的菌液浓度的吸收值在0.30.7范围；高、低剂量浓度标准品溶液所致的菌液浓度的吸收值的差值大于0.1为佳。第108页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四4.比浊法的操作步骤试验准备： 比色管、搅拌转子、塞子的清洗及灭菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培养基、缓冲液的准备、半无菌间的紫外消毒等。 第109页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四4.比浊法的操作步骤供试品、标准品溶液的制备： 估计供试品的效价，根据试验要求设计供试品、标准品溶液稀释步骤，平行制备供试品、标准品相关剂量的溶液。第110页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四4.比浊

58、法的操作步骤菌液培养基的制备： 根据预试验确定加入液体培养基的菌液量，注意制备菌液与培养基充分混匀。第111页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四4.比浊法的操作步骤加抗生素溶液： 在比色管中定量加入抗生素溶液后，再定量加入菌液培养基，混匀后，在规定温度培养。第112页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四4.比浊法的操作步骤菌浓度的测量： 在530nm或其他波长(580nm)处测定各比色管的菌液浓度，注意测定时间的一致性。结果的可靠性检验及效价结果第113页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四5.注意事项：加菌量的影响：加菌量的多少（

59、0.25%、0.5%、1.0%），影响培养至适宜的菌液测定浓度所用的时间，加菌量过少，则测定时可利用的浓度范围窄。各抗生素各浓度之间的吸收度的差值在0.1以上为佳，此时菌液对不同浓度的抗生素敏感，测定误差较低。第114页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四5.注意事项：比色池的清洁： 测定用的比色管需用硝酸硫酸（5：95）浸泡并用蒸馏水冲洗干净，不要有污渍和划痕，与分光光度计的试管要匹配，要清除抗生素残留和清洗液的痕迹，除去纤维等杂质。第115页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四5.注意事项时间的一致性：主要是使每管的培养时间相等，实验时在试管中加入含

60、试验菌液的培养基后，应立即加入标准品溶液和供试品溶液，混合均匀。必要时可先将培养基冷却至24左右，再接种菌种，并在此温度下，将含菌培养基加至各试管中，可避免加注试管先后的误差。培养终止时将各管同时放入冰浴中，并尽快加入甲醛溶液灭活，使各试验管的培养时间一致。 第116页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星期四5.注意事项测定时气泡的影响：在测定比浊法读数前必须将培养基充分摇匀才能准确测定细菌的浓度，但振摇产生的气泡严重干扰了测定结果。如在充分摇匀后放置一段时间，待气泡消失后再进行测定，虽然仍可逐渐下沉，但其误差较小。第117页，共134页，2022年，5月20日，0点21分，星