亚硒酸钠对大鼠肾小球系膜细胞表达p38MAPK和MCP

1、亚硒酸钠对大鼠肾小球系膜细胞表达p38MAPK和MCP【关键词】亚硒酸钠；p38丝裂原活化蛋白激酶；单核细胞趋化蛋白Rlefsdiuseleniteinregulatingexpressinsfp38APKandP1inratesangialells【Abstrat】AI:Tbservetheeffetfsdiuselenitenexpressinsfp38itgenativatedprtEinkinase(p38APK)andnyteheattratantprtein1(P1)inratesangialelllineHBZY1,andtstudytheehanisfsdiuselenitei

2、npreventingdiabetinephrpathy.ETHDS：elllineHBZY1asinubatedithhighgluse,highinsulin,H22andadvanedglysylatinendprduts(AGEs),respetively(ntrlgrup);siultaneusly,theelllineHBZY1pretreatedithsdiuseleniteasalsinubatediththeabvefatrs(experientalgrup).Theexpressinsfp38APKandP1eredetetedandparedinthe2grups.RES

3、ULTS：Furfatrsinreasedtheexpressinsfp38APKandP1indepently;sdiuseleniteinhibitedtheexpressinsfp38APKandP1bythe4fatrsdistintly.NLUSIN：Sdiuseleniteansuppresstheexpressinsfp38APKandP1intheelllineHBZY1,hihsuggeststhatsdiuseleniteayplayasignifiantrleinthepreventinfdiabetinephrpathybytheinhibitinftheexpress

4、insfp38APKandP1intheelllineHBZY1.【Keyrds】sdiuselenite;p38itgenativatedprteinkinase;nyteheattratantprtein1;esangialells;diabetinephrpathy【摘要】目的：观察亚硒酸钠对大鼠肾小球系膜细胞系HBZY1表达p38丝裂原活化蛋白激酶p38APK和单核细胞趋化蛋白1(P1)的影响，从而研究硒在防治糖尿病肾病DN中的作用机制.方法：分别以高葡萄糖、高胰岛素、过氧化氢和糖基化终末产物AGEs刺激HBZY1细胞；先给予100nl/L亚硒酸钠预处理后，再分别以上述4种刺激因素孵育

5、HBZY1细胞，分别检测HBZY1细胞p38APK和P1的表达并比拟.结果：4种刺激因素均可作为独立因素，导致HBZY1细胞p38APK和P1表达量增加；亚硒酸钠能抑制上述4种因素所致的p38APK和P1的表达.结论：亚硒酸钠通过抑制p38APK和P1在HBZY1细胞的表达,从而有效防治DN的发生开展，说明硒在DN的防治过程中发挥积极作用.【关键词】亚硒酸钠；p38丝裂原活化蛋白激酶；单核细胞趋化蛋白1；系膜细胞；糖尿病肾病【中图号】R587.240引言近年来国外研究说明单核细胞趋化蛋白1(nyteheattratantprtein1，P1)与糖尿病肾病diabetinephrpathy,DN

6、有亲密关系1.p38APK是细胞信号传递的交汇点或共同通路2-3，但它在DN发生中的作用及其与P1关系仍不非常清楚；硒是机体必需微量元素之一，其缺乏可加剧DN的氧化应激，并可产生拟高血糖病理状态，从而加剧DN的发生开展4.但其是否作用于p38APK和P1国内外未见文献报道.我们分别给予高葡萄糖(HG)、高胰岛素(HI)、过氧化氢(H22)和糖基化终末产物(AGEs)孵育HBZY1细胞，观察HBZY1细胞p38APK和P1的表达以及亚硒酸钠对HBZY1细胞p38APK和P1表达的影响.从而明确二者在DN形成中的作用及硒在防治DN中的作用机制.1材料和方法1.1材料大鼠肾小球系膜细胞系HBZY1，

7、中国典型培养物保藏中心T；新生牛血清、RPI1640培养液、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗北京中山生物技术；亚硒酸钠(KarlinskaInstitute赠送)；柱离心式总RNA抽提试剂盒、RTPR两步法试剂盒、PR相对分子量标准TaKaRa公司；PR引物合成上海博亚生物技术，蛋白质相对分子量标记物BiRad公司；磷酸化p38APK兔多抗(Prega公司).1.2方法1.2.1细胞系HBZY1的培养HBZY1细胞常规培养于200L/LRPI1640培养液中，培养条件为37，饱和湿度50L/L2，每23日用0.2g/L乙二胺四乙酸EDTA消化传代.HBZY1细胞长满培养瓶底40%后分为9组

8、，以无血清培养液饥饿24h,然后按实验分组参加刺激及干预因素.1.2.2体外制备AGEs参考文献5，按牛血清白蛋白bvineserualbuin,BSA50g/L，与葡萄糖90g/L，0.5l/LEDTA及0.2l/LPBSpH7.4混匀后过滤除菌，37恒温培养箱卵孵育60d.0.1l/LPBSpH7.4中透析48h，测定蛋白含量及荧光强度，分装后存于-80冰箱保存备用.1.2.3实验分组分别以一定浓度HG,HI,H22和AGEs刺激细胞系HBZY1一定时间；先给予亚硒酸钠100nl/L预处理HBZY1细胞48h后，再分别以上述4种刺激因素浓度、时间同前孵育HBZY1细胞，同时设对照组.分组情

9、况如下：对照组：用等体积PBS培养细胞;HG组：用25l/L葡萄糖刺激HBZY1细胞72h;HI组：用100nl/L胰岛素刺激HBZY1细胞24h;H22组：用100l/LH22刺激HBZY1细胞1h;AGEs组：用100g/LAGEs刺激HBZY1细胞6h;亚硒酸钠+HG组：依次以100nl/L亚硒酸钠和25l/L葡萄糖分别刺激HBZY1细胞48h和72h;亚硒酸钠+HI组：依次以100nl/L亚硒酸钠和100nl/L胰岛素分别刺激HBZY1细胞48h和24h;亚硒酸钠+H22组：依次以100nl/L亚硒酸钠和100l/LH22分别刺激HBZY1细胞48h和1h;亚硒酸钠+AGEs组：依次以

10、100nl/L亚硒酸钠和100g/LAGEs分别刺激HBZY1细胞48h和6h.1.2.4RTPR法检测P1RNA表达以柱离心式总RNA抽提试剂盒提取细胞系HBZY1总RNA，测定总RNA浓度，计算纯度，A260n/A280n均在1.82.0之间.P1引物序列按文献6：上游引物：5ATAAGAGAGGTGTAAAGAAGT3；下游引物：5AGAAGTGTTGAGGTGGTTGTGGAAAAGAG3，扩增片段长度258bp.atin引物序列：上游引物：5TTTGATTAAAGGAA3;下游引物：5TTTTTTTTGTGTTTGG3，扩增片段长度228bp.以两步法RTPR试剂盒进展反转录扩增，扩

11、增条件：94变性30s，55退火1in,72延伸1in,共35个循环，72最后延伸7in.每次PR反响至少重复3次.PR产物于15g/L琼脂糖凝胶电泳，结果经图象分析系统扫描存图，并对目的条带进展密度分析.1.2.5esternblt法检测p38APK蛋白表达培养的细胞系HBZY1，经4胞浆蛋白提取液裂解，提取物在冰上孵育2h，然后12000g4离心10in，沉淀参加4预冷核蛋白提取液，震荡混匀，冰浴1h，再12000g4离心30in，取上清为核蛋白，其蛋白浓度经考马斯亮蓝法定量.磷酸化p38APK表达量采用esternblt法检测，核蛋白中参加等体积2上样缓冲液煮沸5in.进展10l/LSD

12、SPAGE，将蛋白转至PVDF膜后用5g/LBSA室温下封闭2h，分别用12000抗磷酸化p38APK兔多抗4孵育过夜，用PBS充分洗涤，再用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG15000，37孵育1h，用PBS充分洗涤，DAB显色试剂盒显色.结果经图象分析系统对目的条带进展扫描存图并进展密度分析.统计学处理：资料采用SAS8.0进展统计分析，组间两两比拟用非参数统计分析，P0.05即认为有统计学差异.2结果2.1细胞系HBZY1P1RNA表达细胞系HBZY1P1RNA表达以atin作为内参照物调整后进展半定量分析，HG，HI，H22和AGEs均可作为独立因素使细胞系HBZY1P1RNA表达量均明

13、显增加P0.01，表1，图1.表1各组细胞系HBZY1P1RTPR和磷酸化p38APKesternblt半定量结果略2.2细胞系HBZY1磷酸化p38APK蛋白表达细胞系HBZY1磷酸化p38APK蛋白表达以atin作为内参照物调整后进展半定量分，HG，HI，H22和AGEs均可作为独立因素激活p38APK，使细胞系HBZY1磷酸化p38APK蛋白表达明显增加P0.01，表1，图2.图1RTPR法检测各组细胞系HBZY1P1RNA和atinRNA表达略图2esternblt法检测各组细胞系HBZY1磷酸化p38APK蛋白和atin蛋白表达略2.3细胞系HBZY1P1RNA表达细胞系HBZY1P

14、1RNA表达以atin作为内参照物调整后进展半定量分析.亚硒酸钠预处理后，再分别给予以上4种刺激因素孵育细胞系HBZY1，可见P1RNA表达量分别较相应未经亚硒酸钠预处理各组明显减少P0.01，表1，图1.2.4细胞系HBZY1磷酸化p38APK蛋白表达的影响HBZY1细胞磷酸化p38APK蛋白表达以atin作为内参照物调整后进展半定量分析.先以亚硒酸钠预处理细胞系HBZY1后，再分别给予上述4种刺激因素刺激细胞系HBZY1，可见磷酸化p38APK蛋白表达量分别较相应未经亚硒酸钠预处理各组显著减少P0.01，但与对照组比拟仍有显著差异P0.01，表1，图2.3讨论本研究结果显示HG,HI,H2

15、2和AGEs均可单独诱导细胞系HBZY1，使其P1RNA表达量明显增加.4种刺激素诱导HBZY1细胞P1RNA表达增加的机制，结合文献和实验结果我们认为有以下几点：高糖有直接刺激P1RNA及蛋白表达增高的作用，该作用是PK，APKs所介导，这可能是DN时肾小球中单核巨噬细胞浸润的重要原因;大量AGEs可以和系膜细胞上的AGEs受体RAGE互相作用，使IB磷酸化而导致NFB激活；新近的研究说明8，AGEs与AGEs受体RAGE互相作用可消耗细胞内谷胱甘肽，产生大量的氧自由基，从而导致细胞内信号传导改变，激活核转录因子NFB/AP1.同时NFB也是调节RAGE表达的一个启动子，它的位点1和位点2的

16、激活可使RAGE表达上调，NFB的激活作为一种正反响，又进一步促进了AGEs与RAGE的结合，导致NFB的持续活化，而活化的NFB可以上调P1RNA和蛋白表达，从而在糖尿病所致肾脏损害中发挥重要作用;过氧化氢可导致系膜细胞氧化应激加剧，诱导细胞内RS产生，从而迅速激活NFB，上调P1表达，在DN发生开展早期起重要作用8;HI可能是通过激活PK，APKs信号通路，引起系膜细胞氧化复原状态发生变化，使细胞内RS产生增加，导致NFB激活，从而使P1表达上调.P1介导糖尿病肾小球损伤.P1不仅对血液中单核细胞有很强的趋化活性，也能通过激活转录因子NFB和AP1来诱导非炎症细胞产生细胞因子和黏附分子，在

17、诱导单核细胞迁入内皮下间隙及渗入肾小球的过程中起重要作用7-8；同时，渗入到肾小球的单核巨噬细胞反过来又刺激部分肾小球细胞，在巨噬细胞衍化生长因子如PDGF和TGF等作用下导致系膜增生和细胞外基质聚集；此外通过炎症细胞因子作用，还可上调黏附分子和趋化因子的分泌，从而进一步有利于白细胞渗入到肾小球7.近年来通过细胞实验及对人和实验动物DN的研究发现，P1在DN的发病机制中起重要作用.p38APK可被多种细胞外刺激激活，导致细胞生长、增殖、分化和调控某些因子表达9-11.本研究以糖尿病时存在的4种应激因素孵育大鼠肾小球系膜细胞系HBZY1，可见p38APK被激活，磷酸化表达增加.硒是机体必需微量元

18、素之一，是谷胱甘肽过氧化物酶的重要组成部分，缺硒可出现拟高血糖症病理状态，引起白蛋白尿和肾小球硬化，从而加剧DN的发生开展；补充硒不仅可预防氧化应激，而且可防止肾脏损伤4,12.本研究结果还显示，亚硒酸钠具有类似p38APK抑制剂所产生的作用，其机制可能是：通过保护系膜细胞免遭氧化损伤而抑制P1的分泌；通过抑制p38APK信号通路而抑制P1在系膜细胞的表达.说明亚硒酸钠可能通过抑制p38APK而延缓DN的发生开展，但亚硒酸钠是否通过抗氧化而抑制p38APK亦或作用于信号通路的其它环节尚需进一步深化讨论，提示硒在防治DN发生开展过程中发挥着积极作用.【参考文献】1BanbaN,NakauraT,

19、atsuura,etal.PssiblerelatinshipfnyteheattratantprtEin1ithdiabetinephrpathyJ.KidneyInt,2000,58(2):684-690.2SakaiN,adaT,FuruihiK,etal.Invlveentfextraellularsignalregulatedkinaseandp38inhuandiabetinephrpathyJ.AJKidneyDis，2022，45(1):54-65.3XuZG,KiKS,ParkH,etal.Highgluseativatesthep38APKpathayinulturedhu

20、anperitnealesthelialellsJ.IntSNep,2022,63(3):958-968.4ReddiAS,BllineniJS.SeleniudefiientdietinduesrenalxidativestressandinjuryviaTGFbeta1innralanddiabetiratsJ.KidneyInt,2001,59(4):1342-1353.5akitaZ,VlassaraH,eraiA,etal.IunheialdetetinfadvanedglysylatinendprdutsinvivJ.JBilhe,1992,267:5133-5138.6LynnEG,SiYL,Karin.Veryldensitylipprteinstiulatestheexpressinfnyteheattratantprtein1esangialellsJ.KidneyInt,2000,57(4):1472-1483.7hristianeV,RalphD,FeiJ,etal.P1induesinflaatryativatinfhuantubularepithelialells:invlveentft