实验三 产果胶酶菌株的筛选

1、本科学生综合性实验报告学号084120155姓名张琰学院生命科学学院专业、班级08生技班实验课程名称教师及职称唐湘华（高级助理实验师）开课学期2010至2011学年上学期填报时间2010年12月28日云南师范大学教务处编印、实验设计方案实验序号三实验名称产果胶酶菌株的筛选实验时间2010.12.13-12.23实验室基础生物2(121)1.实验目的1.1掌握菌种选育、菌种发酵条件的优化和微生物酶制剂酶活测定的基本方法;1.2了解酶学性质的研究。实验原理、实验流程或装置示意图2.1实验原理：2.1.1果胶酶概况2.1.1.1果胶质：是高等植物细胞壁内及细胞壁间的结构性多糖，是一类高分子碳水化合物

2、，它的存在往往给果蔬加工等工艺带来许多麻烦和损失。2.1.1.2果胶酶：是指能分解果胶质的多种酶的总称，广泛存在于高等植物和微生物中。2.1.1.3产生果胶酶的微生物：细菌、放线菌、酵母和霉菌，但目前商品果胶酶多数来自霉菌。2.1.1.4果胶酶的应用：主要是用于果胶的分解，在水果加工、葡萄酒生产、麻类脱胶和饲料等方面有着广泛的应用。2.1.2果胶酶的酶活测定方法2.1.2.1粘度降低法：利用粘度计测量在一定温度、酶浓度和一定反应时间内，标准果胶溶液的粘度降低值。2.1.2.2脱胶作用时间法：以脱胶作用的时间来测定果胶酶的酶活力。2.1.2.3次亚碘酸法：用滴定法定量测定半乳糖醛酸的生成量，以表

3、示果胶酶的活力。2.1.2.4还原糖法(DNS法)：测定在一定温度、酶浓度和一定反应时间内，水解果胶产生的还原糖的量。测定原理：根据果胶酶水解果胶生成半乳糖醛酸，后者是一种还原糖，与3,5-二硝基水杨酸共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定的范围内，还原糖的量和反应液的颜色呈比例关系，可利用比色法在540nm进行测定。2.1.3微生物发酵生产产品受以下条件制约：培养基成分：C源、N源、无机盐、水和生长因子；培养条件：温度、pH、溶解氧等；附加条件：诱导物、表面活性剂等。2.1.4酶催化反应的进行受多种因素的影响：底物浓度；酶浓度；温度；pH；激活剂；抑制剂。2.1.5酶活定义：在pH3.0、

4、37C条件下，每分钟内从底物溶液中分解释放lumol半乳糖醛酸所需要的酶量为一个酶活单位U/g。2.2实验流程：产果胶酶菌种的筛选果胶酶的分离纯化培养测定筛选出的果胶酶的酶活实验设备及材料3.1菌种筛选使用的培养基：3.1.1基本培养基：果胶1.0%、磷酸氢二钠0.5%、蛋白胨1.0%、琼脂2.0%,pH4.53.1.2分离培养基：果胶0.5%、磷酸氢二钠0.5%、琼脂2.0%,pH4.53.1.3发酵培养基果胶1.0%，磷酸氢二钠0.5%，蛋白胨1.0%,pH4.53.2酶活测定使用的试剂：3.2.1柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液：称取柠檬酸15.652g，柠檬酸钠7.5g，溶解定容至1000ml，

5、用0.1MNaOH或0.1MHCl调节pH至3.0。（共配3000ml，分装6瓶）3.2.2底物0.25%果胶溶液：称取0.25g果胶，用上述缓冲液溶解，在电炉上加热至完全溶解，用缓冲液定容至100mL，储存于4C，7天内有效。（共配200ml）3.2.3DNS试剂：称取酒石酸钾钠182.0g，溶解于500mL水中，加热（不超过50C），于热溶液中依次加入3-5二硝基水杨酸6.3g，氢氧化钠21.0g，苯酚5.0g，无水硫酸钠5.0g，搅拌均匀至溶解，冷却后定容至1000mL，储存于棕色瓶中，室温保存，7-10天后过滤使用。3.3实验仪器：烧杯、三角瓶、试管、移液管、洗耳球、量筒、容量瓶、试剂

6、瓶、研钵等；天平、灭菌锅、超净工作台、培养箱、电炉、恒温水浴锅、记时器（精确到秒）、分光光度计等。实验方法步骤及注意事项4.1实验步骤：4.1.1产果胶酶菌种的筛选:菌种采集：到卖水果处寻得一其上有菌体生长的桔子，备用，作为菌种采集来源。基本培养基的配置配制基本培养基，并用灭菌锅灭菌，备用。倒平板（每组两块）分离菌种在无菌操作台内操作，用接种环刮取桔子皮上的菌体，以“之”字型在平板上划线，每组划两块板。然后放置于恒温箱中培养至菌体产生。菌种纯化配制分离培养基，高温灭菌，倒平板（每组两块），备用；将分离平板上的菌体接种在倒有分离培养基的平板上进行菌种分离。4.1.2果胶酶的培养待分离纯化的菌种长

7、出后，配制发酵培养基（每组三瓶），高温灭菌，备用；取两瓶发酵培养基，从分离平板上挖取一块小菌落丢至发酵三角瓶中，摇瓶发酵培养；另从老师提供的斜面上挖取小块菌种丢进剩下的一个三角瓶中，摇瓶发酵培养。4.1.3测果胶酶酶活4.1.3.1绘制标准曲线先配制一系列浓度不同的半乳糖醛酸标准溶液，用选定的显色剂DNS进行显色，在540nm波长下分别测定它们的吸光度A。以A为横坐标，浓度c为纵坐标，则得到一条拟合度较好的直线，称为标准曲线。然后用完全相同的方法和步骤测定被测溶液的吸光度，便可从标准曲线上找出对应的被测溶液浓度或含量。精确称取0.100g半乳糖醛酸，用缓冲溶液定容至100ml，制得浓度为0.1

8、mg/ml的半乳糖醛酸的标准溶液。取7支试管，编号，按照下表进行操作:半乳糖醛酸溶液体积（ml）0.00.20.40.60.81.01.2半乳糖醛酸（mg）0.00.20.40.60.81.01.2缓冲液（ml）2.01.81.61.41.21.00.8DNS(ml)3333333定容总体积（ml）20202020202020OD(540nm)4.1.3.2制备待测酶液取三瓶发酵液，分别离心，取上清液备用；将上清液解释10倍制成稀释酶液待测。4.1.3.3测定酶活取酶液按照下表要求操作测定酶活:操作步骤空白管样品管A样品管B步骤1吸取1.8mL果胶底物溶液吸取1.8mL果胶底物溶液吸取1.8m

9、L果胶底物溶液步骤237C保温5分钟37C保温5分钟37C保温5分钟步骤3加入待测酶液0.2毫加入待测酶液0.2毫升升步骤437C精确保温30min37C精确保温30min37C精确保温30min步骤5加入3mLDNS试剂终止反应加入3mLDNS试剂终止反应加入3mLDNS试剂终止反应步骤6混合均匀混合均匀混合均匀步骤7加入0.2毫升待测酶液，沸水浴煮沸5min沸水浴煮沸5min沸水浴煮沸5min步骤8流水冷却流水冷却流水冷却步骤9加蒸馏水10mL，混匀加蒸馏水10mL，混匀加蒸馏水10mL，混匀步骤10OD比色540nmOD比色540nmOD比色540nmOD=(A+B)/24.1.3.4计

10、算酶活根据酶活计算公式计算酶活。4.2实验注意事项在分离和纯化菌种时，应用力适度，切不可划破培养基，否则，不利于菌种的分离和纯化；纯化菌种时，要挑取分离平板上较小的菌落进行纯化，大片的菌落杂菌较多，同样，发酵培养纯化的产果胶酶菌种时也要挖取较小的单个菌落。在绘制标准曲线时，每浓度OD值要测两次，最终取平均值，以减小误差；加入0.2ml待测酶液时，应小心不要滴在试管壁上，否则煮沸过后可能溶液由于未有酶液还未开始反应；酶活测定时：试管上编号：贴上用圆珠笔写上编号的胶布，以防止保温或沸水加热时脱落；移液枪的使用：向试管内加入待测酶液或DNS时，枪头不要触碰管壁，也不要伸入液面下，连续吸取同一种溶液时

11、可以不用更换枪头！精确记时：每一管加入酶液的时间要记录，每管之间间隔的时间要合理；避免试管进水：煮沸和用流水冲洗时；分光光度计使用时：提前半小时接通电源，打开机器开关使仪器通电，自检；将对照液及测定液分别装入比色杯3/4体积并用镜头纸擦干外壁，放入样品室；调节测定所用波长540nm；以对照为参比；测定的是吸光值；读数完毕，打开仪器盖板，关闭开关，将比色杯冲洗干净、浸泡于30%酒精中。水浴锅使用时：水浴锅的水量（蒸馏水）要超过试管中的液面；各大组“处理时间”这项实验共同在1个水浴锅中进行。实验数据处理方法5.1Excel软件的使用：绘制半乳糖醛酸的标准曲线。5.2酶活计算公式：酶活：E（U/g）

12、=KXAX5XNX1000/（TXW）其中：A:样品的OD值（平均值）K:标准曲线的斜率N:稀释倍数5：0.2毫升反应液转换为1毫升体积T:反应时间（min）1000:转换因子1mmol=1000molW:半乳糖醛酸的分子量（194g/mol）6参考文献【1】余龙江.发酵工程原理与技术应用.北京：化学工业出版社，2006【2】.陈守文.酶工程.北京：科学出版社，2008【3】.宋思扬、楼士林.生物技术概论（第三版）.北京：科学出版社，2007【4】袁勤生、赵健主编酶与酶工程华东理工大学出版社.2005【5】袁勤生主编现代酶学华东理工大学出版社.2001【6】郭勇编酶的生产与应用（第一版）化学工

13、业出版社.2003【7】教师实验课件二、实验报告实验现象与结果及其分析及其结论：1.1产果胶酶的菌种的分离纯化：我们小组的分离平板上的菌种，长出来的较多，且菌落的分布较为合理，便于挑取纯化的菌落；而纯化平板，虽然整个大组，菌种长出来的不多，但是我们组的两块平板上均长出了菌种，且其中一个平板上的菌种分离效果较好，单个小菌落很清晰。1.2绘制标准曲线：所测OD值如下表所示:半乳糖醛酸含量(mg)0.00.20.40.60.81.01.2OD平均值00.1280.3570.4600.6540.8250.935以半乳糖醛酸含量为Y轴，OD平均值为X轴，做标准曲线:半乳糖醛酸标准曲线21864202LO

14、.O.O.0.-O.%量含酸醛糖乳半234567=0.1606x0.1R2=0.9942一系列1线性(系列1620D值标准曲线较为准确，说明我们测量的较为准确，实验数据具有可用性。1.3果胶酶酶活测定果胶酶测定OD值，并计算出平均值：分组、一OD值管号A纯化一纯化二保藏菌种空白000A0.1510.0160.020B0.152-0.0110.021OD平均值0.1520.0160.0201.4酶活的计算：根据OD平均值代入酶活计算公式，得酶活为：纯化一：E=0.1606X0.152X5X10X1000/(30X194)0.210IU纯化二：E=0.1606X0.016X5X10X1000/(3

15、0X194)0.022IU保藏菌种：E=0.1606X0.020X5X10X1000/(30X194)0.0275IU可以很直观的看出来酶活较低。原因可能是分离和纯化培养基的营养物质过于贫瘠，菌种在其上营养过于贫乏，产酶受到了抑制，导致酶活较低。实验总结：2.1实验成败之处及其原因分析成功之处：标准曲线测定的较好，每个点的数据基本在同一条直线上，没有需要丢弃的实验数据，说明操作较为准确，实验数据的可信度高。说明我们在操作时，各种试剂的取用量比较准确，没有太大误差，实验操作也比较规范，尽大可能的减少了实验的系统误差。分离菌种时，得到了菌种，虽然纯化后菌落很少，但是还是分离出来了。失败之处分离出来

16、的菌种整体酶活较低，但是分离的第一组菌种是老师提供的产果胶的菌种酶活的近10倍。我们的第二块平板上的菌种B管所测OD值为负值，酶活为零，说明我们操作时可能酶液滴在了试管壁上，未参加反应，导致酶活无法测出。2.2实验的关键环节及改进措施做好本实验需要把握的关键环节：将培养基装进三角瓶、灭菌时的包扎、划线分离接种、标准曲线的绘制、分光光度计的正确使用、若重做本实验，为实现预期效果，仪器操作和实验步骤的改善方法：应采用不同的菌种采集方式，比如还有土壤采集，因为土壤是微生物的天然培养基，其中有大量的微生物；并且采集地要与果胶的分解密切相关。这样才能更容易分离出具有较高酶活的菌种。对实验的自我评价总的来说，我认为我们小组本次的实验较为成功。首先，我们的分离平板上长的菌种较好，并且纯化平板上长出了不止