细胞免疫检测技术培训课程课件

1、细胞免疫检测技术细胞免疫检测技术细胞免疫Cellmediated immunity is an immune response that does not involve antibodies but rather involves the activation of phagocytes, natural killer cells (NK), antigenspecific cytotoxic Tlymphocytes, and the release of various cytokines in response to an antigen. 细胞免疫（cellular immunity

2、） T细胞受到抗原刺激后，增殖、分化、转化为致敏T细胞(也叫效应T细胞)，当相同抗原再次进入机体的细胞中时，致敏T细胞（效应T细胞）对抗原的直接杀伤作用及致敏T细胞所释放的细胞因子的协同杀伤作用，统称为细胞免疫。细胞免疫Cellmediated immunity is a细胞免疫检测技术培训课程课件检测对象免疫细胞数量（E玫瑰花环形成实验，流式细胞术）T细胞亚群 （间接免疫荧光法，流式细胞术, 免疫磁珠）细胞因子检测技术（ELISA，定量PCR, Elispot）免疫细胞活性 (淋巴细胞转化实验)检测对象免疫细胞数量（E玫瑰花环形成实验，流式细胞术）应用范围1、测定患病个体的细胞免疫状态与水平

3、，以分析其发病机制；2、测定动物疫苗免疫或抗原注射后机体的细胞免疫反应3、筛选免疫增强剂或免疫抑制剂药物，或研究化学药物、营养成分以及物理疗法对机体免疫功能的影响4、在研制细胞因子制剂过程中，测定其活性及效价应用范围1、测定患病个体的细胞免疫状态与水平，以分析其发病机T细胞表面受体一、T细胞抗原受体二、细胞因子受体 三、绵羊红细胞受体四、有丝分裂原受体T细胞表面受体一、T细胞抗原受体T细胞亚群辅助/诱导T淋巴细胞（CD3+CD4+）、抑制/细胞毒T淋巴细胞（CD3+CD8+）、CD4+T细胞纯真亚群（CD4+CD45RA+/ CD4+CD45RA+62L+）和记忆亚群（CD4+CD45RA/

4、CD4+CD45RO+）、功能亚群（CD28+）、激活亚群（CD38+、HLADR+）、凋亡亚群（CD95+） T细胞亚群辅助/诱导T淋巴细胞（CD3+CD4+）、抑制/细1. E玫瑰花环形成试验 erythocyte rosette test实验原理人和动物外周血中T细胞表面有红细胞受体（即CD2分子），在体外能直接和异种或同种动物红细胞（SRBC）结合形成玫瑰花样细胞团，以此来区分T、B。 TTBSRBCCD2检测技术1. E玫瑰花环形成试验 erythocyte rosett左:（甲紫染色，800）：可见2个被绵羊红细胞包围而形成玫瑰环的T淋巴细胞；右:（吖啶橙染色）：图中可见3个染成橙

5、黄色荧光的T淋巴细胞被绵羊红细胞所包围。左:（甲紫染色，800）：可见2个被绵羊红细胞包围而形成玫B细胞没有红细胞受体，但有免疫球蛋白Fc受体和补体C3受体，故可用抗红细胞抗体（A）或者补体（C）搭桥，形成EA玫瑰花环实验和EAC玫瑰花环实验。B细胞没有红细胞受体，但有免疫球蛋白Fc受体和补体C3受体，在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。免疫细胞数量（E玫瑰花环形成实验，流式细胞术）免疫细胞活性 (淋巴细胞转化实验)免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。将指定数目的能产

6、生 IFN- 的T细胞与一百万个抗原呈现细胞（Antigen Presenting Cells，APC）混合后，使用 ELISPOT 法（上图）、胞质内染法（中图）和 ELISA 法（下图）分别测量产生 IFN- 的细胞的数目。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。流式细胞术 T细胞亚群细胞合成的DNA越多，则所掺入的3HTdR就越多，因此，检测所掺入的3HTdR就可反映细胞增殖的程度。一种细胞分选或分析技术。B细胞没有红细胞受体，但有免疫球蛋白Fc受体和补体C3受体，故可用抗红细胞抗体（A）或者补体（C）搭桥，形成EA玫瑰花环实验和EAC玫瑰花环实验。定义流式细胞术(F

7、lowCytometry,FCM)是七十年代发展起来的高科学技术,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体,同时具有分析和分选细胞功能。092，淋巴细胞为1.加分裂原共同培养后，观察形态学变化，计算转化为母细胞的百分数固相酶联免疫斑点技术 ELISPOTBCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过ELISPOT酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果.MTT 法即四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法。2.流式细胞术定义流式细胞术(FlowCytometry,FCM)是七十年代发展起来的高科学技术,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化

8、学、细胞免疫学于一体,同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析,在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析;能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度95%。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。 一种细胞分选或分析技术。即以荧光素标记抗体结合相应细胞，用激光束激发单行流动的细胞，根据细胞所携带荧光(强度或类别)进行分选或分析。 检测技术在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。细胞免疫检测技术培训课程课件将待

9、测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷 酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品压入流动流式细胞术 T细胞亚群具有CD3抗原的T细胞外周血成熟的T细胞具有CD4抗原的T细胞TH（机体免疫应答的启动细胞，促进T细胞、B细胞免疫应答，活化的TH细胞可释放IL2及IFNr）具有CD8抗原的T细胞Tc（在TH辅助下特异性杀伤或溶解靶细胞）流式细胞术 T细胞亚群具有CD3抗原的T细胞外周

10、血成熟的T细细胞免疫检测技术培训课程课件3. 间接免疫荧光法检测淋巴细胞CD抗原免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。 检测技术3. 间接免疫荧光法检测淋巴细胞CD抗原免疫荧光技术就是将不一种细胞分选或分析技术。实验原理人和动物外周血中T细胞表面有红细胞受体（即CD2分子），在体外能直接和异种或同种动物红细胞（SRBC）结合形成玫瑰花样细胞团，以此来区分T、B。4、在研制细胞因子制剂过程中，测定其活性及效价4、在研制细胞因子制剂过程中，测定其活性及效价细胞受到ConA 作用后发生增殖活化，其胞

11、内线粒体琥珀酸脱氢酶活性相应升高，MTT 作为其底物参与反应，形成蓝色的甲臜（Formazan）颗粒沉积于细胞内或细胞周围，经溶剂溶解后为蓝色溶液，可用酶标测定仪测定细胞培养物的OD 值，测定波长570nm。MTT 是一种噻唑盐，化学名3（4，5二甲基2噻唑）2，5二苯基溴化四唑，水溶液为黄橙色。2、测定动物疫苗免疫或抗原注射后机体的细胞免疫反应磁珠(microbead)1、鸡脾淋巴细胞悬液制备间接免疫荧光法检测淋巴细胞CD抗原实验孔cpm SI= 对照孔cpm用多头细胞收集器将细胞取集于玻璃纤维滤纸上。3HTdR的结果则为73，A组细胞的增殖是B组的2.BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔

12、板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过ELISPOT酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果.2、测定动物疫苗免疫或抗原注射后机体的细胞免疫反应细胞因子检测技术（ELISA，定量PCR, Elispot）一种细胞分选或分析技术。置5% CO2，37培养72h，培养结束前6h，每孔加入3HTdR 20L，使其终浓度为（3.细胞体积增大，代谢旺盛，蛋白和核酸合成增加,即向淋巴母细胞转化。4. 免疫磁珠分离法 * 免疫磁珠分离法将针对细胞某种表面标记的特异性抗体包被在磁性微珠上，与磁珠交联的抗体能够特异性结合具有这种表面标记的细胞，然后用强磁场可将具有这种表面标记的细胞分离出来。磁珠(mic

13、robead)标记细胞上的磁珠在扫描电镜下也几乎看不到检测技术一种细胞分选或分析技术。4. 免疫磁珠分离法 * 免疫磁珠分磁珠分离策略一. 阳性分选磁珠标记目的细胞未标记细胞先行流出移出磁场后收集目的细胞CD4+T细胞分离柱CD4-T细胞磁珠分离策略一. 阳性分选磁珠标记目的细胞未标记细胞先行流出磁珠标记非目的细胞目的细胞先行流出二. 阴性分选磁珠标记非目的细胞目的细胞先行流出二. 阴性分选5. 固相酶联免疫斑点技术 ELISPOT 细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后， 被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。BCIP

14、/NBT底物孵育后，PVDF孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过ELISPOT酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果. 检测技术5. 固相酶联免疫斑点技术 ELISPOT 细胞受到刺激后与ELISA的区别 1、ELISA通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出定量的可溶性蛋白总量。 2、ELISPOT通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过ELISPOT分析系统对斑点进行计数，1个斑点代表1个活性细胞，从而计算出分泌该蛋白或者细胞因子的细胞的频率3、由于是单细胞水平检测，ELISPOT比ELISA和有限

15、稀释法等更灵敏，能从 20万30万 细胞中检出 1个 分泌该蛋白的细胞。 4、捕获抗体不会影响活化细胞分泌细胞因子。 与ELISA的区别 1、ELISA通过显色反应，在酶图注：ELISPOT 法在检测低频率产生细胞因子的细胞时具有独一无二的敏感性。将指定数目的能产生 IFN- 的T细胞与一百万个抗原呈现细胞（Antigen Presenting Cells，APC）混合后，使用 ELISPOT 法（上图）、胞质内染法（中图）和 ELISA 法（下图）分别测量产生 IFN- 的细胞的数目。 图注：ELISPOT 法在检测低频率产生细胞因子的细胞时具有细胞免疫检测技术培训课程课件6. T淋巴细胞转

16、化实验T细胞、B细胞表面具有识别抗原的受体和有丝分裂原受体，在特异性抗原刺激下可使相应淋巴细胞克隆发生增殖。检测技术6. T淋巴细胞转化实验T细胞、B细胞表面具有识别抗原的受原儿茶酸对SPF鸡的免疫刺激试验MTT 法即四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法。4、在研制细胞因子制剂过程中，测定其活性及效价抗IgM、含葡萄球菌A蛋白的菌体（SAC）、脂多糖（LPS，对小鼠有作用）则刺激B细胞发生增殖；定义流式细胞术(FlowCytometry,FCM)是七十年代发展起来的高科学技术,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体,同时具有分析和分选细胞功能。细胞因子检测技术（ELISA，定

17、量PCR, Elispot）B细胞没有红细胞受体，但有免疫球蛋白Fc受体和补体C3受体，故可用抗红细胞抗体（A）或者补体（C）搭桥，形成EA玫瑰花环实验和EAC玫瑰花环实验。加分裂原共同培养后，观察形态学变化，计算转化为母细胞的百分数3HTdR即（甲基3H）胸腺嘧啶核苷，是DNA合成的前体。受试样品组的SI值显著高于对照组的SI值，即可判定该项实验结果阳性。移出磁场后收集目的细胞092，淋巴细胞为1.MTT 是一种噻唑盐，化学名3（4，5二甲基2噻唑）2，5二苯基溴化四唑，水溶液为黄橙色。3HTdR的结果则为73，A组细胞的增殖是B组的2.将指定数目的能产生 IFN- 的T细胞与一百万个抗原呈

18、现细胞（Antigen Presenting Cells，APC）混合后，使用 ELISPOT 法（上图）、胞质内染法（中图）和 ELISA 法（下图）分别测量产生 IFN- 的细胞的数目。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过ELISPOT酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果.固相酶联免疫斑点技术 ELISPOT右:（吖啶橙染色）：图中可见3个染成橙黄色荧光的T淋巴细胞被绵羊红细胞所包围。细胞因子检测技术（ELISA，定量PCR, Elispot）BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过ELISP

19、OT酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果.细胞受到ConA 作用后发生增殖活化，其胞内线粒体琥珀酸脱氢酶活性相应升高，MTT 作为其底物参与反应，形成蓝色的甲臜（Formazan）颗粒沉积于细胞内或细胞周围，经溶剂溶解后为蓝色溶液，可用酶标测定仪测定细胞培养物的OD 值，测定波长570nm。植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白A（ConA），抗CD2、抗CD3McAb作为多克隆刺激剂可选择性地刺激T细胞增殖；抗IgM、含葡萄球菌A蛋白的菌体（SAC）、脂多糖（LPS，对小鼠有作用）则刺激B细胞发生增殖；美洲商陆（PWM）、肿瘤刺激剂PMA对 T、B细胞的增殖均有刺激作用。 原儿茶酸对SPF鸡的免疫

20、刺激试验植物血凝素（PHA）、刀豆蛋淋巴细胞转化试验方法 形态计数法MTT 法同位素掺入法淋巴细胞转化试验方法 形态计数法形态计数法加分裂原共同培养后，观察形态学变化，计算转化为母细胞的百分数 细胞体积增大，代谢旺盛，蛋白和核酸合成增加,即向淋巴母细胞转化。形态计数法加分裂原共同培养后，观察形态学变化，计算转化为母细MTT 法MTT 法即四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法。MTT 是一种噻唑盐，化学名3（4，5二甲基2噻唑）2，5二苯基溴化四唑，水溶液为黄橙色。细胞受到ConA 作用后发生增殖活化，其胞内线粒体琥珀酸脱氢酶活性相应升高，MTT 作为其底物参与反应，形成蓝色的甲臜（Formazan）

21、颗粒沉积于细胞内或细胞周围，经溶剂溶解后为蓝色溶液，可用酶标测定仪测定细胞培养物的OD 值，测定波长570nm。根据OD 值的大小计算反应体系中细胞增殖程度。MTT 法MTT 法即四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法。同位素法3HTdR 掺入法细胞增殖的基本条件或前提为细胞质和细胞核的复制，这是正常细胞增殖过程缺一不可的前提。3HTdR即（甲基3H）胸腺嘧啶核苷，是DNA合成的前体。加入细胞培养液中后被细胞摄取作为DNA合成的原料。细胞合成的DNA越多，则所掺入的3HTdR就越多，因此，检测所掺入的3HTdR就可反映细胞增殖的程度。因该方法有同位素污染问题，故我们实习中仍用MTT法。同位素法3HTd

22、R 掺入法细胞增殖的基本条件或前提为细胞质和同位素法优势3HTdR=增殖细胞数；MTT=总细胞数。所以前者更能反映细胞增殖指数。例，培养10个细胞，3天后A组为17个，B组为13个，此为MTT的结果；3HTdR的结果则为73，A组细胞的增殖是B组的2.3倍。 同位素法优势3HTdR=增殖细胞数；MTT=总细胞数。所以前实验步骤1、鸡脾淋巴细胞悬液制备淋巴细胞的分离用1640培养液配成106细胞/ml实验步骤1、鸡脾淋巴细胞悬液制备淋巴细胞的分离用1640培养2、淋巴细胞增殖反应将脾细胞悬液加入到96孔培养板中，200L/孔，每一份脾细胞悬液分装6个孔，3孔加ConA（5ug/mL），另3个孔不

23、加ConA 作为对照。置5% CO2，37培养72h，培养结束前6h，每孔加入3HTdR 20L，使其终浓度为（3.718.5）104Bq/mL。用多头细胞收集器将细胞取集于玻璃纤维滤纸上。滤纸片充分干燥后置测量瓶中，加入7mL闪烁液，用液闪仪测定每分钟脉冲数（cpm）。3、数据处理及结果判定以每分钟脉冲数（cpm）表示增殖程度，用刺激指数（SI）来表示 实验孔cpm SI= 对照孔cpm受试样品组的SI值显著高于对照组的SI值，即可判定该项实验结果阳性。2、淋巴细胞增殖反应原儿茶酸对SPF鸡的免疫刺激试验Poultry Science, 2012,91 :16041609 原儿茶酸对SPF鸡

24、的免疫刺激试验Poultry Scienc免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。淋巴细胞转化试验方法受试样品组的SI值显著高于对照组的SI值，即可判定该项实验结果阳性。流式细胞术 T细胞亚群滤纸片充分干燥后置测量瓶中，加入7mL闪烁液，用液闪仪测定每分钟脉冲数（cpm）。细胞体积增大，代谢旺盛，蛋白和核酸合成增加,即向淋巴母细胞转化。T细胞、B细胞表面具有识别抗原的受体和有丝分裂原受体，在特异性抗原刺激下可使相应淋巴细胞克隆发生增殖。定义流式细胞术(FlowCytometry,FCM)是七十年

25、代发展起来的高科学技术,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体,同时具有分析和分选细胞功能。一种细胞分选或分析技术。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过ELISPOT酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果.具有CD4抗原的T细胞TH（机体免疫应答的启动细胞，促进T细胞、B细胞免疫应答，活化的TH细胞可释放IL2及IFNr）将待测细胞染色后制成单细胞悬液。细胞分解后， 被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。具有CD4抗原的T细

26、胞TH（机体免疫应答的启动细胞，促进T细胞、B细胞免疫应答，活化的TH细胞可释放IL2及IFNr）它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析,在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析;能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度95%。抗IgM、含葡萄球菌A蛋白的菌体（SAC）、脂多糖（LPS，对小鼠有作用）则刺激B细胞发生增殖；细胞免疫（cellular immunity） T细胞受到抗原刺激后，增殖、分化、转化为致敏T细胞(也叫效应T细胞)，当相同抗原再次进入机体的细胞中时，

27、致敏T细胞（效应T细胞）对抗原的直接杀伤作用及致敏T细胞所释放的细胞因子的协同杀伤作用，统称为细胞免疫。加分裂原共同培养后，观察形态学变化，计算转化为母细胞的百分数以每分钟脉冲数（cpm）表示增殖程度，用刺激指数（SI）来表示T细胞、B细胞表面具有识别抗原的受体和有丝分裂原受体，在特异性抗原刺激下可使相应淋巴细胞克隆发生增殖。MTT 是一种噻唑盐，化学名3（4，5二甲基2噻唑）2，5二苯基溴化四唑，水溶液为黄橙色。MTT 是一种噻唑盐，化学名3（4，5二甲基2噻唑）2，5二苯基溴化四唑，水溶液为黄橙色。2、测定动物疫苗免疫或抗原注射后机体的细胞免疫反应在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物

28、学等学科广泛应用。受试样品组的SI值显著高于对照组的SI值，即可判定该项实验结果阳性。具有CD8抗原的T细胞Tc（在TH辅助下特异性杀伤或溶解靶细胞）免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。MTT 法即四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法。细胞分解后， 被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。将待测细胞染色后制成单细胞悬液。定义流式细胞术(FlowCytometry,FCM)是七十年代发展起来的高科学技术,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一

29、体,同时具有分析和分选细胞功能。移出磁场后收集目的细胞一种细胞分选或分析技术。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过ELISPOT酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果.抗IgM、含葡萄球菌A蛋白的菌体（SAC）、脂多糖（LPS，对小鼠有作用）则刺激B细胞发生增殖；* 免疫磁珠分离法将针对细胞某种表面标记的特异性抗体包被在磁性微珠上，与磁珠交联的抗体能够特异性结合具有这种表面标记的细胞，然后用强磁场可将具有这种表面标记的细胞分离出来。3HTdR即（甲基3H）胸腺嘧啶核苷，是DNA合成的前体。将指定数目的能产生 IFN- 的T细胞与一百万个抗原呈现细胞（Antigen Presenting Cells，APC）混合后，使用 ELISPOT 法（上图）、胞质内染法（中图）和 ELISA 法（下图）分别测