发酵工艺的知识

1、关于发酵工艺知识第1页，共61页，2022年，5月20日，3点2分，星期四绪论一、发酵过程监测和控制参数二、发酵过程中几个重要参数的影响及其控制三、发酵过程中泡沫的消长规律和控制方法四、发酵终点的判断第2页，共61页，2022年，5月20日，3点2分，星期四一 发酵过程监测和控制参数（物理、化学、生物）1. 物理参数2. 化学参数3. 生物参数第3页，共61页，2022年，5月20日，3点2分，星期四1. 物理参数1.温度（）2.压力(Pa) 3.搅拌转速(r/min) 4.搅拌功率（KW） 5.空气流量（V/（Vmin） 6.粘度（Pas） 7.浊度（%）8.料液流量（L/min）第4页，共

2、61页，2022年，5月20日，3点2分，星期四2. 化学参数1.pH（酸碱度）2.基质浓度（g或mg%）3.溶解氧浓度（ppm或饱和度，%）4.氧化还原位(mV) 5.产物的浓度(g(u)/ml) 6.废气中的氧浓度（Pa）7.废气中的CO2浓度（%） 第5页，共61页，2022年，5月20日，3点2分，星期四3. 生物参数菌丝形态:通过观察发酵过程中不同时期的菌丝形态来判断发酵的生产潜力和发酵终点。菌浓和菌龄第6页，共61页，2022年，5月20日，3点2分，星期四二、发酵过程中几个重要参数的影响及其控制（一）温度对发酵过程的影响及其控制1影响发酵温度的因索(1)生物热(Q生物):微生物分

3、解蛋白质、糖、脂肪等生物氧化过程产生大量的能量，一部分转变为热能散发出来，称为生物能。不同微生物产热程度不同，比如辅酶Q10产生的生物热比霉酚酸的要多。(2)搅拌热(Q搅拌):机械装置的摩擦、机械装置和发酵液之间摩擦产生一定量的机械热的释放。(3)蒸发热(Q蒸发)(4)辐射热(Q辐射)第7页，共61页，2022年，5月20日，3点2分，星期四2温度对微生物生长和产物形成的影响1.从酶动力学角度来看，酶促反应导致温度升高，反应速率加大，生长代谢加快，生产期提前。但因酶本身很容易因热而失去活性，温度越高，酶的失活也越快，表现在菌体易于哀老，发酵周期缩短，影响产物的最终产量。2.温度会影响基质和氧在

4、发酵液中的溶氧相和传递速率、菌体对某些基质的分解吸收速度等改变发酵液的物理性质，间接影响菌体的生物合成第8页，共61页，2022年，5月20日，3点2分，星期四3.发酵温度的控制按控制方法分为自控和手控。自控的优点：操作方便，温度控制平稳，可以提高抗生素的产量。手控的优点：设备故障、温度波动大等特殊情况下控制效果比较突出。第9页，共61页，2022年，5月20日，3点2分，星期四按使用水系统分为冷冻水、热水和高温水（自来水）冷冻水：适用放热相对较大的种子罐和发酵罐。热水：适用于放热相对较小的种子罐。高温水：适用于刚灭菌结束需要降温的种子罐和发酵罐。第10页，共61页，2022年，5月20日，3

5、点2分，星期四4最适温度的选择所谓最适温度是指在该温度下最适宜于菌体生长或产物的合成。对不同的菌种和不同的培养条件以及不同的酶反应和不同的生长阶段，最适温度应有所不同第11页，共61页，2022年，5月20日，3点2分，星期四5.实例分析霉酚酸和辅酶Q10霉酚酸种子罐控制温度28，发酵罐控制温度28。辅酶Q10种子罐控制温度32，发酵罐控制温度34。一级种子罐一般情况下使用热水控制（原因：蒸发热生物热搅拌热，反之，当蒸发热生物热搅拌热，应该使用冷冻水控制）二级种子罐和发酵罐一般使用冷冻水控制（原因：产生的生物热较大）第12页，共61页，2022年，5月20日，3点2分，星期四（二）、pH值对发

6、酵过程的影响及控制1影响pH值变化的因素-引起发酵液pH值下降的因素有：培养基中碳、氮比例不当，碳源过多，特别是葡萄糖过量；或者中间补糖过多加之溶解氧不足，致使有机酸大量积累；消沫油加得过多；生理酸性物质过多，氨被利用。第13页，共61页，2022年，5月20日，3点2分，星期四-引起发酵液pH值上升的因素有：培养基中碳、氮肥比例不当，氮源过多，氨基酸释放；生理碱性物质过多；中间补料时氨水或尿素等碱性物质的加入量过多。第14页，共61页，2022年，5月20日，3点2分，星期四2pH值对菌体生长和产物形成的影响培养液的pH值是微生物庞杂的代谢过程的综合反映。反之，环境的pH值也能影响微生物的代

7、谢和形态 pH值能影响酶促反应和代谢途径的变化 微生物发育阶段，最适pH值并不一致，但大多数不超越49的范围。第15页，共61页，2022年，5月20日，3点2分，星期四3最适pH值的选择及其控制发酵过程的pH值控制主要是合理组合培养基，使培养液的PH值变化随着发酵正常进行，始终保持在最佳范围之中 常用的方法有：(1)调整培养基中生理碱性和生理酸性盐类的比例；(2)选择不同代谢速度的碳氮源的种类和比例；(3)在培养基中添加缓冲剂。第16页，共61页，2022年，5月20日，3点2分，星期四4.调节pH的方式按调节pH的物质可以分为：酸性调节和碱性调节。按调节pH的时机不同可以分为：培养基调节和

8、培养时调节。第17页，共61页，2022年，5月20日，3点2分，星期四5.发酵液pH值高如何调节？由于某些事故造成发酵液pH高而使抗生素合成停滞，可用小体积的生理酸性营养物质加入发酵液以调节pH。比如玉米浆、硫酸铵、磷酸二氢钾等生理酸性物质可以调节，一般不适合用强酸，比如盐酸、硫酸等直接调节pH，强酸调整pH可能严重损伤菌丝体和培养基营养成分。第18页，共61页，2022年，5月20日，3点2分，星期四6.控制pH值的应急措施(1)改变搅拌转速或通气量，以改变溶解氧浓度，控制有机酸的积累量及其代谢速度；(2)改变温度，以控制微生物代谢速度；(3)改变罐压及通气量，改变溶解CO2浓度；(4)改

9、变加油或加糖量等，调节有机酸的积累量第19页，共61页，2022年，5月20日，3点2分，星期四7.实例分析霉酚酸1.一级种子罐碱性调节，培养基调节：灭菌前用液碱调节培养基pH到6.5。2.二级种子罐和发酵罐酸性调节，培养基调节：灭菌前用盐酸调节培养基pH到4.5。第20页，共61页，2022年，5月20日，3点2分，星期四辅酶Q10发酵罐培养控制pH在6.506.60，采用氨水自控调节。pH调节过高（不严重）采用加入合适的生理酸性物质（磷酸二氢钾）调节，pH调节太高造成菌丝体严重损伤，将无法调节。第21页，共61页，2022年，5月20日，3点2分，星期四（三）、基质浓度对发酵过程的影响及其

10、控制1、碳源的种类和浓度的影响和控制碳源，按利用快慢而言，有迅速利用的碳源和缓慢利用的碳源 迅速利用的碳源，能迅速地参与代谢、合成菌体和产生能量，并产生分解产物（如丙酮酸等），有利于菌体生长。但有的分解代谢产物对产物的合成可能产生阻遏作用。 缓慢利用的碳源，多数为聚合物（也有例外），为菌体缓慢利用，有利于延长代谢产物的合成，特别有利于延长抗生素的分泌期。碳源的浓度也有明显的影响 第22页，共61页，2022年，5月20日，3点2分，星期四2、氮源的种类和浓度的影响和控制氮源象碳源一样，按利用快慢分，也有迅速利用的氮源和缓慢利用的氮源。前者如氨基（或铵）态氮的氨基酸（或硫酸铵等）和玉米浆等，后者

11、如黄豆饼粉、花生饼粉、棉子饼粉等蛋白质。它们各有自己的作用。速效氮源容易被菌体所利用，促进菌体生长，但对某些代谢产物的合成，特别是某些抗生素的合成产生调节作用，影响产量。按氮源的组分，可以分为有机氮源和无机氮源。第23页，共61页，2022年，5月20日，3点2分，星期四3、磷酸盐浓度的影响和控制磷是微生物菌体生长繁殖所必需的成分，也是合成代谢产物所必需的 磷酸盐浓度的控制，一般是在基础培养基中采用适当的浓度。对于初级代谢来说，要求不如次级代谢那样严格第24页，共61页，2022年，5月20日，3点2分，星期四4、发酵过程的代谢变化规律及其控制一、分批发酵分批培养是指在一封闭培养系统内含有初始

12、限制量的基质的发酵方法。二、补料分批发酵补料分批发酵是指在分批培养过程中，连续地或是间歇地补加培养基(或是某一营养成分)，而不从发酵器中间断地放出培养液第25页，共61页，2022年，5月20日，3点2分，星期四5、发酵工业采用补料分批培养技术的优越性(1)可使底物的残留浓度保持在较低的水平，以免微生物受到这些底物的调节作用。(2)能够增加微生物细脑的合成能力。因为通过补料工艺能够不断地提供足够的养料用于合成微生物细胞。 (3)能够提高非生长偶联型产物(如抗生素等次级代谢产物)的合成量。因为通过补料工艺可在微生物生长期和产物合成期提供不同质和不问量的养分用于微生物生长和产物合成。(4)可以解除

13、快速利用底物而造成的阻遏效应。(5)能够降低发酵液的粘度，提高溶解氧的浓度。(6)可以防止培养基中某一组分的毒性。第26页，共61页，2022年，5月20日，3点2分，星期四实例分析霉酚酸分批发酵碳源：主要是葡萄糖（1520），属于快速利用碳源，其他氨基乙酸和甲硫氨酸也是碳源。氮源：氨基乙酸和甲硫氨酸第27页，共61页，2022年，5月20日，3点2分，星期四辅酶Q10分批发酵：补料发酵，发酵培养不断补入葡萄糖和磷酸盐溶液。碳源：主要是葡萄糖，属于快速利用碳源。葡萄糖浓度控制在1左右，可使菌丝产抗处于最佳状态。氮源：有机氮源（玉米浆粉等） 无机氮源（硫酸铵等）磷酸盐溶液：不断补入磷酸二氢钾溶液

14、控制磷酸盐浓度。第28页，共61页，2022年，5月20日，3点2分，星期四（四）、溶解氧对发酵过程的影响及其控制1.需氧微生物发酵时，主要是利用溶解于水中的氧，只有当这种氧达到细胞的呼吸部位才能发生作用。通入发酵罐的氧不是全部溶解在培养基中，所以菌丝只是利用通入氧的极小部分，但是作用极大。第29页，共61页，2022年，5月20日，3点2分，星期四2.影响氧溶解速度的因素空气和发酵液的接触面积和时间。空气分布圈，搅拌，挡板等。发酵罐体积。发酵罐体积越大，氧的溶解速度越快。搅拌强度。影响最大，加快搅拌可减少空气的需求量。发酵液粘度。空气流速和空气压力。罐压提高，加快。第30页，共61页，202

15、2年，5月20日，3点2分，星期四3.供氧不足对发酵液的影响供氧不足会造成微生物对营养物质的有氧氧化过程不能彻底进行，有氧氧化不彻底影响生物能的释放和抗生素合成所需前体物质的积累，因此供氧不足使菌丝体生长不良，抗生素产量不高。第31页，共61页，2022年，5月20日，3点2分，星期四实例分析：霉酚酸特点：氧的需求量较大。1.通气量大：32立方米/小时以上2.搅拌强度大：50HZ，最大3.罐压：0.03MPa第32页，共61页，2022年，5月20日，3点2分，星期四辅酶Q10特点：需要适当的供氧1.通气量比霉酚酸小：1525立方米/小时2.搅拌强度：35HZ3.罐压：0.03MPa第33页，

16、共61页，2022年，5月20日，3点2分，星期四利普斯他汀（XL，减肥药）特点：控制适当的溶解氧在一定范围内。空气、罐压、搅拌强度控制，使得溶解氧在工艺要求范围内。第34页，共61页，2022年，5月20日，3点2分，星期四（五）、菌体浓度的影响和控制菌体（细胞）浓度是指单位体积养液中菌体的含量 菌浓的大小与菌体生长速率有密切关系 而菌体的生长速率与微生物的种类和自身的遗传特性有关，不同种类的微生物的生长速率是不一样 菌浓的大小，对发酵产特的得率有着重要的影响 ，影响板框的渣子含量。第35页，共61页，2022年，5月20日，3点2分，星期四（六）、二氧化碳的影响和控制CO2是微生物生长繁殖

17、过程中的代谢产物，也是某些合成代谢的基质，对微生物生长和发酵具有刺激或抑制作用 CO2对菌体生长还具有抑制作用，排气中CO2浓度高于4%时，菌体的代谢和呼吸速率都下降 CO2对微生物发酵也有影响 CO2影响培养液的酸-碱平衡第36页，共61页，2022年，5月20日，3点2分，星期四三、泡沫对发酵过程的影响及其控制1.发酵过程中产生泡沫的原因：微生物在沉没培养过程中由于通气和搅拌引起的，这种泡沫称为机械性泡沫，一般在发酵前期出现发酵中后期出现的抱沫称为发酵性泡沫，它与微生物菌种的代谢性和培养基组分等有关 原材料质量问题、培养基灭菌使用蒸汽不当、接种吼使用空气量不当、消泡方法不当、罐温控制不当等

18、因素第37页，共61页，2022年，5月20日，3点2分，星期四2.发酵过程产生泡沫是否正常？发酵过程产生泡沫是正常现象。不产生泡沫：发酵不正常，菌丝生长不良。泡沫失控：发酵不正常，可能代谢异常第38页，共61页，2022年，5月20日，3点2分，星期四3、发酵过程中泡沫的消长规律和控制方法发酵过程中泡沫一般出现发酵的中后期，由于菌丝的大量自溶消亡而产生。泡沫控制的方法可归结为机械消沫和消沫剂消沫两大类 机械捎沫是依靠物理学原理，促使泡沫破裂 ，机械消沫器。消沫剂消沫的原理是降低泡沫液膜的机械强度和降低液膜的表面粘度。第39页，共61页，2022年，5月20日，3点2分，星期四4.实例分析灭菌

19、前培养基中加入泡敌的用途消毒过程通入蒸汽会产生泡沫，部分培养基分解容易产生泡沫发酵罐机械泡沫发酵培养中的泡沫第40页，共61页，2022年，5月20日，3点2分，星期四辅酶Q10发酵罐中后期产生大量泡沫，即将逃液时补入适量的泡敌抑制泡沫。泡敌对菌丝有一定的毒害作用，补入过多造成菌丝生长不良。第41页，共61页，2022年，5月20日，3点2分，星期四四、发酵终点的判断一是产品的质量 主要考虑因素是菌丝的生长潜力及其对后续发酵产物提取工艺的影响。二是经济效益 第42页，共61页，2022年，5月20日，3点2分，星期四第八章 工业发酵染菌的防治1.绪论2.常见的染菌途径3.发酵过程中染菌的检查判

20、断4.染菌原因的分析5.发酵染菌的防止 6.染菌后的挽救措施第43页，共61页，2022年，5月20日，3点2分，星期四1.绪论发酵染菌能给生产带来严重危害，防止杂菌污染是任何发酵工厂的一项重要工作内容。 “染菌”定义： 是指在发酵培养中侵入了有碍生产的其他微生物。染菌的后果：轻者影响产量或产品质量，重者可能导致倒罐，甚至停产。所以我们在发酵生产过程中必须对每一存在染菌隐患的工艺环节严密把关。治理发酵染菌的八字方针：以预防为主，“防重于治”！第44页，共61页，2022年，5月20日，3点2分，星期四2.常见的染菌途径1）种子带菌2）设备及附件渗漏造成的染菌3）培养基实罐灭菌不彻底导致染菌4）

21、空气系统导致染菌5）补料系统导致染菌第45页，共61页，2022年，5月20日，3点2分，星期四3.发酵过程中染菌的检查判断目前生产上常用的检查方法 ： 显微镜检查； 平板划线检查； 肉汤培养检查 。 判断发酵是否染菌应以无菌试验结果为根据。无菌试验的目的：（1）监测培养基、发酵罐及附属设备灭菌是否彻底（2）监测发酵过程中是否有杂菌从外界侵入（3）了解整个生产过程中是否存在染菌的隐患和死角第46页，共61页，2022年，5月20日，3点2分，星期四4.染菌原因的分析1）从染菌的规模来分析染菌原因 2）从染菌的时间来分析 3）从染菌的类型来分析 第47页，共61页，2022年，5月20日，3点2

22、分，星期四从染菌的规模来分析染菌原因一）大批发酵罐染菌 大批的发酵罐（罐组）都出现染菌现象而且染的是同一种菌，一般先从公用系统和补料系统中找问题或是种子进罐带杂菌。二）个别发酵罐连续染菌和偶然染菌个别发酵罐连续染菌大多是由设备问题造成的，如阀门的渗漏或罐体腐蚀磨损，特别是冷却管的不易觉察的穿孔等。设备的腐蚀磨损所引起的染菌会出现每批发酵的染菌时间向前推移的现象，即第二批的染菌时间比第一批提早，第三批又比第二批提早。至于个别发酵罐的偶然染菌其原因比较复杂，因为各种染菌途径都可能引起。 第48页，共61页，2022年，5月20日，3点2分，星期四从染菌的时间来分析发酵早期染菌，一般认为除了种子带菌

23、外，还有培养液灭菌或设备灭菌不彻底所致，而中、后期染菌则与这些原因的关系较少，而与中间补料、设备渗漏以及操作不合理等有关。第49页，共61页，2022年，5月20日，3点2分，星期四从染菌的类型来分析所染杂菌的类型也是判断染菌原因的重要依据之一。一般认为，污染耐热性芽抱杆菌多数是由于设备存在死角、培养液灭菌不彻底或空气过滤器过滤不彻底所致。污染球菌、酵母等可能是从蒸汽的冷凝水或空气中带来的。在检查时如平板上出现的是浅绿色菌落(革兰氏阴性杆菌)，由于这种菌主要生存在水中，所以发酵罐的冷却管或夹套渗漏所引起的可能性较大。污染霉菌大多是灭菌不彻底或无菌操作不严格所致。第50页，共61页，2022年，

24、5月20日，3点2分，星期四实例分析1、种子罐连续染芽孢杆菌原因：可能性最大是空气过滤不彻底解决方法：更换空气过滤器滤芯，并且将过滤器重新消毒。第51页，共61页，2022年，5月20日，3点2分，星期四2、连续几批辅酶Q10发酵后期出现染杆菌。原因：发酵后期开始补泡敌，很有可能是泡敌罐带菌或者泡敌管路有泄漏。解决方法：检查泡敌罐和管路，重新消毒。第52页，共61页，2022年，5月20日，3点2分，星期四3、生产辅酶Q10，82307罐连续出现染杆菌。原因：82307罐体存在设备问题方法：检查罐体，更换阀片。第53页，共61页，2022年，5月20日，3点2分，星期四5.发酵染菌的防治 一）种子带菌的防治种子带杂菌是发酵前期染菌的原因之一。在每次接种后应留取少量的种子悬浮液进行平板、肉汤培养，借以说明是否是种子中带杂菌。 二）发酵设备、管件的渗漏的检查设备和管件的渗漏一般是指设备和管件由于腐蚀、内应力或其他原因形成微小漏孔所发生的渗漏现象。这些漏孔很小，特别是不锈钢材料形成的漏孔更小，有时肉眼不能直接觉察，需要通过一定的试漏方法才能发现。一般采用肥皂水试漏。第54页，共61页，2022年，5月20日，3点