浅谈乙肝病毒检测课件

1、乙肝病毒检测乙肝病毒检测病毒鉴定方法一、分离培养方法二、快速诊断方法1、光学显微镜检查 病毒包涵体及某些大病毒颗粒的检查2、电子显微镜的检查 电镜直接检查 免疫电镜检查3、血清学检查4、病毒基因组检查 核酸杂交和聚合酶链反应病毒鉴定方法一、分离培养方法乙肝病毒检测一、乙肝五项（两对半）二、乙肝病毒核酸定量检测乙肝病毒检测一、乙肝五项（两对半） HBV抗原抗体系统检测临床意义HBsAg抗-HBsHBeAg抗-HBe抗-HBc临床意义IgMIgG+-感染或无症状携带者+-+-+-急性或慢性乙型肝炎（传染性强） （大三阳）+-+-+急性肝炎趋向恢复（小三阳）-+-+-+既往感染恢复期-+-+-既往感

2、染恢复期-+既往感染-+-既往感染或接种疫苗-未感染，无免疫力 HBV抗原抗体系统检测临床意义HBsAg抗-HBsHBeA浅谈乙肝病毒检测课件浅谈乙肝病毒检测课件二、乙肝病毒核酸定量检测1.检测原理 利用荧光PCR技术，以HBV基因组中相对保守区为靶区域，设计特异引物及荧光探针，通过PCR对DNA进行快速定量检测。 荧光探针TaqMan 探针实时荧光 PCR 技术。在 PCR 反应过程中，同时利用 Taq 酶的 53聚合酶活性和核酸外切酶活性，使得 TaqMan 探针降解，荧光报告基团和淬灭基团分离使得荧光信号发射， FAM 荧光检测乙型肝炎病毒JOE/RED610 nm 波长通道检测内参。二

3、、乙肝病毒核酸定量检测1.检测原理PCR分四个阶段PCR分四个阶段如何定量？Ct值的概念Ct值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数。如何定量？Ct值的概念定量原理确定初始模板的浓度初始 DNA量越多, 荧光达到某一值（域值）时所需要的循环数越少Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量定量原理确定初始模板的浓度初始 DNA量越多, 荧光达到某荧光化学SYBR Green 1 TaqMan荧光化学SYBR Green 1 TaqManTaqManTaqManSYBR Green I 工作原理。 SYBR G

4、reen 1 结合到双链DNA的小沟部位SYBR Green 1 染料只有和双链DNA结合后才发荧光GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAAGTTTTTTGGGGCCCCCCCCAAAAATACCGGGGTTACGAACGGTAAT未结合SYBR Green 1 dye变性: 无荧光信号SYBR Green I 工作原理。 SYBR Green2.所用试剂组分名称规格数量主要成分 核酸提取试剂DNA提取液I4.5ml/瓶2DNA提取液质控品及阳性定量参考品阴性质控品250ul/管1HBV阴性血清强阳性质控品250ul/管1灭活HBV阳性血清临界阳性质控品250u

5、l/管1灭活HBV阳性血清HBV定量参考品（2.0X106IU/ml）250ul/管1灭活HBV阳性血清HBV定量参考品（2.0X105IU/ml）250ul/管1灭活HBV阳性血清HBV定量参考品（2.0X104IU/ml）250ul/管1灭活HBV阳性血清HBV定量参考品（2.0X103IU/ml）250ul/管1灭活HBV阳性血清 PCR检测试剂HBV-内标溶液100ul/管1内标质粒及稳定剂HBV-PCR反应管1人一份/管20引物、探针、taq酶等2.所用试剂组分名称规格数量主要成分 核酸提取试剂D3、实验步骤1.DNA提取 将待测样本、阳性定量参考品、阴性质控品、HBV强阳性质控品、

6、 HBV临界质控品进行同步处理。1.1 取200 L样品，加入450 L DNA提取液I和4 L内标溶液，用振荡器剧烈震荡摇匀15秒，瞬时离心数秒，100处理10分钟1.2 12000rpm离心5分钟，备用2.PCR试剂准备直接使用HBV-PCR反应管3. 加样HBV-PCR反应管分别加入将待测样本、阳性定量参考品、阴性质控品、HBV强阳性质控品、 HBV临界质控品上清20 L。盖紧管盖，8000rpm离心数秒后扩增3、实验步骤1.DNA提取4.PCR扩增对各标本进行标记反应条件：93 2分钟93 45秒55 60秒10个循环93 30秒45 60秒30个循环FAM通道检测HBV核酸，VIC通

7、道检测内标4.PCR扩增4.结果判定1 如果在FAM检测通道检测扩增曲线无明显对数期或Ct值等于30，VIC检测通道扩增曲线有明显对数期，则为阴性或小于检测灵敏度2 FAM检测通道扩增曲线有明显对数期且Ct值小于30按以下方法判断：C100,HBV DNA浓度5.0E+008 ,HBV DNA浓度5.0X108 IU/ml 如需精确定量结果，可将样品用阴性质控品稀释到线性范围后再检测，则样品HBV DNA浓度=（CX稀释倍数） IU/ml4.结果判定5.注意事项1 每次实验需检测阴性质控品、HBV强阳性质控品、 HBV临界质控品，满足要求方可进行判定（阳性质控品Ct30，阴性质控品无明显对数期

8、或Ct值等于30 VIC检测通道扩增曲线有明显对数期）2 本试剂盒的最低检出浓度为30IU/ml，最低定量浓度为100IU/ml3 所有样品包括质控品均按传染性标本对待严格遵循无菌操作（带口罩手套），所有操作在生物安全柜内操作，物品不能随意带出生物安全柜，用完的物品集中放置高压灭菌后方可处置。5.注意事项一、乙肝病毒e抗原检测1.检测原理 在微孔板上预包被鼠抗-Hbe单克隆抗体（ HbeAb），配以辣根过氧化物酶标鼠抗-Hbe单克隆抗体（ HbeAb-HRP）及TMB（四甲基联苯胺）等试剂，采用双抗夹心法检测血清中的乙肝病毒e抗原（ HbeAg）一、乙肝病毒e抗原检测1.检测原理浅谈乙肝病毒检

9、测课件2.所用试剂组成成分规格组成成分规格1.HbeAg微孔板（包被鼠抗-Hbe单克隆抗体（ HbeAb）96TX块7.底物B（过氧化氢）7mlX1支2.HbeAg酶标抗体（辣根过氧化物酶标鼠抗-Hbe单克隆抗体）3.5mlX1支8.终止液7mlX1支3.HbeAg阳性对照血清（含HbeAg阳性血清）1mlX1支9.封口膜2张4.HbeAg阴性对照血清（正常人血清）1mlX1支10.自封袋1个5.浓缩洗涤（PBS-T缓冲液）12.5mlX1支11. 说明书1张6.底物A（过氧化氢）7mlX1支2.所用试剂组成成分规格组成成分规格1.HbeAg微孔板963、实验步骤1.平衡 试剂盒个组分取出，平

10、衡至室温（16-25）余者以自封袋封存2.配液 浓缩洗涤液摇匀后，用蒸馏水或去离子水按1:19稀释备用3. 编号 微孔条固定于支架，按序编号4.加样 分别用加样器加入阳性对照血清、阴性对照血清50 L（各加两孔），待测血清50 L（1孔），空白对照（不加）3、实验步骤1.平衡5.加酶 每空加酶标抗体50 L，混匀（空白对照不加）6.温浴 37温浴25分钟，室温平衡5分钟（封口膜覆盖孔口，避免其他因素影响）7.洗涤 洗涤液充分洗涤5次，洗涤完扣干（每次应保持30-60秒的浸泡时间）8.显色 每孔加入A、B底物50 L，混匀，37暗置15分钟9.终止 每孔加50 L终止液50 L，混匀10.测定 酶标仪单波长450nm或双波长450/630nm测定各空OD值，记录结果,30分钟内测定完成）5.加酶4.结果判定1. 临界值(C.O)计算 临界值=阴性对照孔OD值均值N X 2.1 注意：阴性对照孔均值N大于0.1应重新实验，小于0.05按0.05计算2. 结果判定样品OD值/ C.O 1为HbeAg阳性样品OD值/ C.O 1为HbeAg阳性3.阴性对照孔均值N大于0.1或阳性对照均值0.4实验无