定基因工程的概述

1、第一章 基因工程能发荧光的热带斑马鱼普通热带斑马鱼是不发荧光的第一节 基因工程的概述 又叫基因拼接技术或DNA重组技术。指在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞，并使重组基因在受体细胞中表达，产生人类需要的基因产物的技术。一、 什么是基因工程 获得人类所需的基因产物 结 果 剪切、拼接、导入、表达基本过程 DNA分子水平操作水平 基 因操作对象 生物体外操作环境基因拼接技术、DNA重组技术等 别 名二、转基因操作的工具一、限制性核酸内切酶“分子手术刀”主要来源：种类与命名：作用特点：4.限制酶识别序列5.作用结果：识别特定核苷酸序列原核生物产生

2、黏性末端或平末端,切断磷酸二酯键具有特异性。一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成少数的识别序列由4、5或8个核苷酸组成种类与命名： 现在已经从约300种微生物中分离出了约4000种限制性内切酶(限制酶)。EcoRSma粘质沙雷氏杆菌（Serratia marcesens）大肠杆菌（Escherichia coli R）Go back练习：流感嗜血杆菌的d菌株( Haemophilus influenzae d )中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:Hind、Hind和Hind磷酸二酯键限制酶识别DNA特定的序列,使D

3、NA分子链的固定部位分开。.Sma平末端平末端EcoR黏性末端黏性末端Go backEcoR黏性末端黏性末端Go back重复演示要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？要切两个切口，产生四个黏性(平)末端。如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？ 会产生相同的黏性(平)末端，然后让两者的黏性(平)末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。思考?二、“分子缝合针” DNA连接酶作用: 把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接起来.作用原理：催化磷酸二酯键形成 可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，Ecoli DNA

4、连接酶或T4DNA连接酶即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低T4DNA连接酶类型：类型EcoliDNA连接酶T4DNA连接酶来源功能大肠杆菌T4噬菌体恢复磷酸二酯键只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端(效率较低)相同点差别（二）“分子缝合针”DNA连接酶DNA连接酶与DNA聚合酶的比较DNA聚合酶DNA连接酶化学本质作用部位模板蛋白质蛋白质磷酸二酯键（单个脱氧核苷酸+片段） 磷酸二酯键（DNA双链片段 +DNA双链片段）需要（DNA一条链）不需要“分子运输车”质粒质粒：裸露、结构简单、独立于细菌染色体之外，具有自我复制

5、能力的双链环状DNA分子。3、运载体（运载工具）载基因进入受体细胞常用的运载体主要有两类： 1）细菌细胞质的质粒 2）噬菌体或某些动植物病毒1、至少有一个（多个）限制酶切割位点，供外源DNA片段插入其中。2、重组运载体进入受体细胞后（或整合到染色体、DNA上），在受体细胞存在并进行自我复制。3，有特殊的遗传标记基因，如抗四环素、氨苄青霉素等标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。（2）运载体的特点DNA重组技术的三件工具：限制性内切酶、DNA连接酶、运载体。总结质粒目的基因限制性内切酶连接酶重组质粒基因工程的基本操作程序1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因

6、的检测与鉴定一、目的基因的获取1、目的基因主要是指_编码蛋白质的结构基因2、获取目的基因的常用方法（1）从基因文库中获取（2）利用PCR技术扩增（3）人工合成概念：基因文库 （gene library）基因组文库部分基因文库（如cDNA文库） 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库(gene library)（1）从基因文库中获取目的基因基因组文库: 基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库.部分基因文库: 基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库.基因组文库与部分基因

7、文库的关系 如果用某种生物发育的某个时期的mRNA 反转录产生的多种互补DNA（也叫cDNA）片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，那么，这个受体菌群体就构成了这种生物的cDNA文库。这种方法称反转录法cDNA文库的构建（2）利用PCR技术扩增目的基因PCR聚合酶链式反应 是一项生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过此技术，可获取大量的目的基因。PCR技术原理：前提：原料方式PCR扩增仪DNA复制一段已知目的基因的核苷酸序列：以_方式扩增， 即_（n为扩增循环的次数）指数2n模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；离子 过程变性、退火、延伸三步曲变性：

8、加热至9095双链DNA解链成为单链DNA退火：冷却至5560部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸：加热至7075以目的基因为模板，合成互补的新DNA链变性退火延伸（3） 人工合成根据已知的氨基酸序列合成DNA 蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成质粒目的基因限制酶处理一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶表达载体同种1.过程:二、基因表达载体的构建核心2、基因表达载体的作用a、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代b、同时使目的基因能表达和发挥作用思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？

9、为什么？3.基因表达载体的组成：它们有什么作用？a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因位于基因的首端,是mRNA结合位点位于基因的末端,终止转录检测目的基因是否导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。将目的基因导入受体细胞的原理：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。（一）转化： 目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程受体细胞稳定表达（二）方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法显微注射法感受态细胞1.将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉

10、管通道法（1）农杆菌转化法特点： 易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力原理： Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。转化过程:Ti质粒目的基因构建表达载体导入植物细胞插入植物细胞染色DNA表达新性状转入农杆菌 基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。（2）基因枪法适用于单子叶植物（3）花粉管通道法 植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因

11、），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。适用于被子植物2.将目的基因导入动物细胞（1）方法：显微注射法（将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受精卵中）思考：为什么要用受精卵而不用体细胞？（2）操作程序:提纯含目的基因表达载体取受精卵显微注射移植到子宫受精卵发育新性状动物常用法：Ca2+处理常用菌：大肠杆菌微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少过程：Ca2+处理大肠杆菌感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA3.将目的基因导入微生物细胞思考：为什么要用Ca2+处理受体细胞？用Ca2处理，增加细菌细胞膜的通透性四、目的基因的检测与鉴定 分子水平检测是否插入目的基因是

12、否转录是否翻译 个体生物学水平检测鉴定1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 首先取出转基因生物的基因组DNA；（1）方法:DNA分子杂交（2）过程: 将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针； 使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中。（一）检测知识延伸DNA分子杂交技术 该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNA解开，把单股的DNA小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的DNA中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。（二）鉴定（个体生物学水平）2、检测目的基因是否转录出了mR

13、NA3、检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法:分 子 杂 交方法:抗原-抗体杂交过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA。怎样检验抗虫基因在棉细胞内是否表达呢？没有抗虫基因的棉植株有抗虫基因的棉植株棉铃虫虫没有死虫被杀死没有表达目的基因表达类型步骤检测内容方法结果显示分子检测第一步目的基因是否进入受体细胞DNA分子杂交（DNA和DNA之间）是否成功显示出杂交带第二步目的基因是否转录出mRNA分子杂交技术（DNA和mRNA之间）是否成功显示出杂交带第三步目的基因是否翻译出蛋白质抗原抗体杂交是否成功显示出杂交带个体水平鉴定 包

14、括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度； 基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是否相同等。目的基因的表达和检测对位训练1.下列有关基因工程技术的叙述,正确的是（ ） A.重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、连接酶 和载体 B.所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸 序列 C.选用细菌作为重组质粒的受体细胞是因为细菌 繁殖快 D.只要目的基因进入受体细胞就能实现表达C2.利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所 需要的产品。下列选项中能说明目的基因完成了 在受体细胞中表达的是（ ） A棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因 B大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNA C

15、山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNA序列 D酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白D3、在遗传工程中，若有一个控制有利性状的DNA分子片段为ATGTGTACAC，要使其数量增多，可用PCR技术进行人工复制，复制时应给予的条件是 双链DNA分子为模板 ATGTG或TACAC模板链 四种脱氧核苷酸 四种核苷酸 DNA聚合酶 热稳定DNA聚合酶引物 温度变化 恒温A BC DD4、（多选）一个基因表达载体的构建应包括A目的基因 B启动子 C终止子 D标记基因ABCD5、下列关于基因表达载体的叙述不正确的是A启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起始密码B启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对mRN

16、A的转录起调控作用C标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选D基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别A6、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是A.人工合成基因 B.目的基因与运载体结合C.将目的基因导入受体细胞 D.目的基因的检测和表达C 例1 （08年全国卷理综1）4.已知某种限制性内切酶在一线性DNA分子上有3个酶切位点，如图中箭头所指，如果该线性DNA分子在3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生a、b、c、d四种不同长度的DNA片段。 现在多个上述线性DNA分子，若在每个DNA分子上至少有1个酶切位点被该

17、酶切断，则从理论上讲，经该酶切后，这些线性DNA分子最多能产生长度不同的DNA片段种类数是 A.3 B.4 C.9 D. 12 答案：C2(高考试题：2007全国理综II)下列有关基因工程中限制内切酶的描术，错误的是A.一种限制性内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列B.限制性内切酶的活性受温度的影响C.限制性内切酶能别和切割RNAD、限制性内切酶可从原核生物中提取3、【生物现代生物技术专题】为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。（1）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中的 处，DNA连接酶

18、作用于 处。（填“a”或“b”）（2） 将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和 法。（3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用 技术。该技术的核心是 。（4）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的 作探针进行分子杂交检测，又要用 方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。基因枪法（花粉管通道法）植物组织培养去分化和再分化耐盐基因一定浓度盐水浇灌（移栽到盐碱地中）41979年，科学家将动物体内的能够合成胰岛素的基因与大肠杆菌的DNA分子重组，并且在大肠杆菌中表达成功。如右图，请据图回答问题。(1)此图表示的是采取_ _方法获取_基因的过程。人工（反转录）胰岛素目的基因(2)图中DNA是以_ _为模板，_形成单链DNA，在酶的作用下合成双链DNA，从而获得了所需要的基因。胰岛素mRNA逆转录 (3)图中代表的是_酶，在它的作