番茄叶片中DNA、RNA的提取

1、重庆大学研究生专业实验教学实验报告书实验课程名称：实验指导教师：学院：专业及类别：学号：姓名：实验日期：成绩：重庆大学研究生院制实验目的1、掌握番茄叶片中DNA、RNA提取的原理与操作过程；2、了解DNA、RNA的组分，掌握DNA、RNA定性检测的具体方法；3、掌握DNA、RNA的浓度与电泳测定方法。二、实验原理1、DNA的提取原理植物组织中绝大部分是核DNA，它和组蛋白、非组蛋白结合在一起，以核蛋白（即染色质或染色体）的形式存在于细胞核内。CTAB（十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammoniumbromide,简称CTAB）：是一一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它

2、能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度（0.3mol/LNaCl）时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇中。在DNA提取过程中必须始终注意以下几个关键问题：（1）DNA的二级结构和双链易受多种因素（如强酸、强碱、加热、低盐浓度、有机溶剂、酰胺类、尿素等）的影响引起双链解开，即“变性”，因此抽提时避免使用变性的条件。（2）抑制内外源DNase的活力。DNase就象一把刀，它能把大分子的DNA切成碎片，所以要加

3、以杜绝，现可以通过多种途径来做到这一点：2、低温操作；b、调节pH，使偏碱（pH8.0）；c、抽提液中加表面活性剂；d、加螯合剂（EDTA）除去酶的铺助因子（Mg2+），使酶活性丧失。（3）防止化学降解。如过酸或过碱以及其它化学因素，会使DNA降解，一般综合考虑，取pH8.0左右为宜。（4）防止物理因素降解。如温度太高或机械张力剪切等，DNA分子特别大，其分子量可达1012道尔顿，极易被机械张力拉断，甚至在细管中稍急一些的流动也会使DNA断裂，所以在抽提过程中要特别注意这一点，操作过程要尽量简便、温和、减少搅拌次数，也不要剧烈摇动。（5）植物的次生代谢物（主要是胞质内的多酚类或色素类化合物）对

4、核酸提取有干扰作用。因此，一般尽可能选幼嫩的、代谢旺盛的新生组织作为提取DNA的材料，这是因幼嫩的新生组织次生代谢物较少，DNA含量高，且易于破碎，植物材料最好是新鲜的。分离提取植物DNA的方法很多，本实验采用CTAB法提取DNA并通过电泳鉴定。2、RNA的提取原理细胞中的RNA可以分为信使RNA、转运RNA和核糖体RNAm大类，不同组织总RNA提取的实质就是将细胞裂解，释放出RNA，并通过不同方式去除蛋白，DNA等杂质，最终获得高纯度RNA产物的过程。RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA，必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。高浓度强变性剂异硫氰酸胍可

5、溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失丫活人酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了RNA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。三、实验试剂与仪器1、实验试剂液氮、CTABbuffer、B-巯基乙醇、异戊醇、醋酸铵、1XTEbuffer、70%乙醇、RNAisoPlus裂解液、异丙醇、75%乙醇、氯仿、RNase-free水、琼脂糖，冰2、实验仪器水平板型电泳槽装置、电泳仪、移液枪、2ml离心管、1.5山1离心管、离心机、棉手套、塑料手套、电脑、烧杯四、实验步骤1、DNA的提取在液氮中将番茄叶片研磨成粉末；将研磨的样品粉

6、末迅速转到经液氮预冷的2ml离心管中（约加到离心管400-500ulJ度处），加入1mlExtractionBuffer（CTABbuffe再勘口入20ulB-巯基乙醇，吹打或震荡混匀；65孵育15min,5min后颠倒混匀；加入氯仿：异戊醇（体积比24:1）714立，室温条件下8000rpm，离心5山也；取上清液700ul转入新的1.5ml离心管中，加入70ul3M醋酸铵，颠倒混匀；加入726血的异戊醇，颠倒混匀；室温条件下，7500rpm，离心5山也，去掉上清液，加入70%乙醇600ul清洗沉淀2次；13000rpm离心15山皿，弃掉乙醇，室温干燥；向干燥的DNA加入50-100ul的1X

7、TEbuffer（或无菌水）溶解DNA。2、RNA的提取将1.5ml离心管提前用马克笔做好标记；在液氮中将番茄叶片研磨成粉末；将研磨好的样品迅速装入预冷的1.5ml离心管中，样品的量到达离心管0.1刻度处，将离心管置于液氮中暂时保存，直到所有样品都研磨完毕；用镊子取出置于液氮中的盛有样品的1.5ml离心管，向管中加入1ml的RNAisoPlus裂解液，迅速震荡匀浆，直至匀浆液呈无颗粒透明状，室温静置5min,然后12000rpm,4离心5min；小心吸取上清液（950ul）,移入新的离心管中，向匀浆裂解液中加入氯仿200ul,盖紧离心管盖，用手剧烈震荡15秒，待溶液充分乳化后，再室温静置5mi

8、n,然后12000rpm,4离心15min；从离心机中小心取出离心管，吸取上清液（250-320ul）转移至另一新的离心管中，再向上清液中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15-30下静置10min,然后12000rpm,4离心10min；从离心机中小心取出离心管，弃上清液后，缓慢地沿离心管壁加入75%的乙醇1ml,轻轻上下颠倒洗涤离心管壁，12000rpm,4离心5min后小心弃去乙醇；室温干燥沉淀2-5min,加入适量（30-50ul）的RNase-free水溶解沉淀，必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀，RNA完全溶解后放置于冰上；制作琼脂糖凝胶，取2-3ul进行凝胶电泳，以查看R

9、NA提取的完整性。五、实验结果与分析1、实验结果图1DNA凝胶电泳条带图2RNA凝胶电泳条带实验结果如图1与图2所示，图1中从右至左的第3条为本组的DNA凝胶电泳条带，图2中的从右至左的第4条（样品1）与第6条（样品2）为本组的RNA凝胶电泳条带。2、结果分析DNA提取的分析由本组的DNA凝胶电泳条带可知，我们组已成功提取出了番茄植物的DNA，条带的亮度很暗，这说明DNA浓度较低。出现这一现象的原因可能是样品中的部分DNA被降解或断裂。在DNA的提取过程中，可能造成其降解的因素主要有以下几方面：加入提取液后，提取时间太久，这有可能造成部分降解。降入氯仿/异戊醇后，剧烈混匀时间太久，造成部分DN

10、A断裂。打碎组织时最好用液氮处理后研磨的方式，用珠子打碎在后期混匀过程中也容易造成DNA断裂。因此，在实验过程中一定要避免出现此类现象。RNA提取的分析本组在进行RNA提取实验时，制备了两个样品。样品1的RNA凝胶电泳条带大致能看出由三个条带，但颜色很浅，这表示RNA浓度较低，样品1成功提取出了番茄植株的RNA；而样品2的RNA凝胶电泳条带的末端出现了一段很明亮的条段，这说明样品2中的RNAE被降解，没能成功提取出番茄植株的RNA。出现这一现象的原因可能是样品1中的RNA几乎被RNA酶完全讲解，而样品2只是少量被降解了。在RNA的提取过程中，其很容易被降解，为了防止RNA的降解，在实验操作过程

11、中应特别注意以下几个方面：所有用到的枪头、离心管都要在0.1%的DEPC水里浸泡过夜够，灭菌烘干使用，当然这些耗材都有现成商业化的买。所有实验中用到水的地方都是0.1%的DEPC水（灭菌失活）。液氮研磨，裂解时间不宜太长、拟南芥、水稻等模式作物抽提一次就可以用，有些作物需要纯化，粗提出的RNA尽快纯化，不要放太长时间。DNA酶处理的时间要短，不超过30分钟。尽量在低温的条件下操作，戴口罩，在冰上操作时注意不要有水碰到管口、自来水，说话时的口气、唾沫都会污染RNA。六、实验总结我本科所学专业是材料科学与工程，本次DNA、RNA的提取实验是我继高中后首次接触这方面的知识。实验课开始，老师先给我们先给我们详细讲解了DNA、RNA提取的原理、方法与注意事项等方面，然后才是实验操作部分。本次实验是两个人一组，我觉得两个人一组刚刚好，这不仅让每个同学都有亲自操作的机会，遇见问题时两个同学还可以互相探讨。本次实验我是跟同一课题组的马娜同学一组的，她本科就是生物学专业的同学，在DNA、RNA的提取上有丰富的理论知识与实践经历，她知道我本科不是生物学的，在实验过程给予了我很多帮助与鼓励，最开始的时候，我不敢自己操作，因为我老是觉得自