中药指纹图谱研究课件

1、中药指纹图谱研究 指纹图谱(fingerprint)系指某种中药材或中药制剂，经适当处理后采用一定的分析手段得到的、能表示该样品特征的色谱、光谱或其它图谱。一、为什么要研究中药指纹图谱（一）中药质量分析的现状质量稳定的原料是生产质量稳定的产品的先决条件。中药材绝大部分来源于生物，包括植物药和动物药。中药活性成分大部分为生物体内次生代谢产物，少数为初生代谢产物。 产地、气候、生态环境、栽培或养殖技术、产地加工、炮制方法等对中药材的化学成分影响很大。 目前大部分中药的有效成分未被阐明或仅部分阐明。 随着现代科学手段引入到中药的品质研究中，通过利用植物学，植物化学，分析化学以及药理学等相关学科的研究

2、方法，开辟了中药品质评价的新天地。 中药的质量研究发展到普遍采用色谱学手段，分析中药材或中药制剂中的化学成分，并针对其中的一个或两个成分进行定性或定量分析，无论在药典、部颁标准和地方标准，还是现在申报的新药研究资料中，采用这种方式进行质量的评价已成为主流。（二）国外植物药的质量分析概况 国外对植物类中药，所含有的植物化学成分是质量控制的依据，对该类植物药极其制剂的质量评价方法的建立，则是建立于全面的化学及药理学研究的基础之上， 如著名的银杏叶标准制剂EGB761的标准，不仅仅控制总黄酮和总内脂的含量，而且对黄酮中槲皮素、山柰酚和异鼠李素的比例，总内脂中银杏内脂A，B，C，J和白果内脂的比例，规

3、定了较为明确的范围。从而全面的反映出制剂的质量内涵。 国际植物药市场中出现的标准植物药制剂的概念，就是基于制剂中可控成分的分析结果来体现的。目前国际植物药市场发展迅速， 我国虽拥有传统中医药的优势，但在这个大市场中只是以原料或半成品的出口国的身份参与其中，所占市场份额与收益均不理想，其中重要的原因之一是产品质控技术含量低，不能有效地说明和保证产品质量。 1中药指纹图谱的定义与特点1）中药指纹图谱的定义： 中药指纹图谱是指某种（或某产地）中药材或中成药中所共有的、具有特征性的某类或数类成分的色谱或光谱的图谱。（2）中药指纹图谱的特点： 中药指纹图谱的特点：突破了传统的线性思维，采用多学科、多领域

4、的先进分析技术，着眼于宏观规律性研究，建立客观、整体和多指标的综合评价体系，在阐述中药的活性成分的同时，阐明其中的其它成分，能够展示各类成分的全貌，是当前国际公认的有效的质量控制技术、能够对中药材、中药制剂（包括半成品和成品）质量的真伪优劣与稳定性作出较全面的评价。1）通过指纹图谱的特征性，能有效鉴别样品的真伪或产地； 2）通过指纹图谱主要特征峰的面积 或比例的制定，能有效控制样品的质量，确保样品质量的相对稳定。3中药指纹图谱的建立：应以系统的化学成分研究和药理学研究为依托；应体现系统性、特征性、稳定性三个基本原则。（1）系统性： 指的是指纹图谱所反映的化学成分，应包括中药有效部位所含大部分的

5、种类，或指标成分的全部。如中药人参中所含的有效成分多为皂苷类化合物，则其指纹谱应尽可能多的反映其中的皂苷成分；银杏叶的有效成分是黄酮和银杏内酯类，则其指纹谱可采用两种方法针对这两类成分，分别分析，以达到系统全面的目的。（3）稳定性： 指的是所建立的指纹图谱，在规定的方法与条件下，不同的操作者和不同的实验室应能作出相同的指纹图谱，其误差应在允许的范围内，这样才可以保证指纹图谱的使用具有通用性和时间性，也是作为标准方法所必备的特征之一。二中药材指纹图谱研究的一般方法主要介绍与中药（新药）注射剂指纹图谱技术申报要求有关的研究内容样品收集为了确保指纹谱的系统性，必须进行具有广泛代表性的样品收集，尤其是

6、不同产地、不同采收期及加工方式的样品的收集，只有保证了样品的代表性，才能保证建立的指纹谱的有效性。（一）指纹图谱的检测标准内容： 名称、汉语拼音、拉丁名、来源、供试品和参照物的制备、检测方法、指纹图谱及技术参数。1、名称、汉语拼音按中药命名原则制定如：黄芪【名称】黄芪【汉语拼音】Huangqi2、来源原植、动物：科名、中文名、拉丁学名、药用部位、产地、 采收季节、产地加工、炮制方法等。矿物药：矿物的类、族、矿石名或岩石名、主要成分、产地、产地加工、炮制方法等。如：黄芪【基源】本品为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. var. mongho

7、licus (Bge.) Hsiao的干燥根。【产地】内蒙古自治区固阳县。【采收期】10月中旬至11月中旬。【产地加工】除去须根及根头，晒干。【炮制方法】除去杂质，大小分开，洗净，润透，切厚片，干燥。 其性状、鉴别、检查、含量测定、浸出物等项应符合中华人民共和国药典2000年版一部249页黄芪项下的各项规定。3、供试品的制备应根据中药材中所含化学成分的理化性质和检测方法的需要，选择适宜的方法进行制备。制备方法必须确保该中药材的主要化学成分在指纹图谱中的体现。对于仅提取其中某类或数类成分的中药材，除按化学成分的性质提取各类成分制定指纹图谱外，还需按注射剂制备工艺制备供试品，制定指纹图谱，用以分析

8、中药材与注射剂指纹图谱的相关性。4、参照物的制备制定指纹图谱必须设立参照物。应根据供试品中所含成分的性质，选择适宜的对照品作为参照物，如果没有适宜的对照品，可选择适宜的内标物作为参照物。参照物的制备应根据检测方法的需要，选择适宜的方法进行制备。例：黄芪1)黄芪甲苷对照品溶液的制备：取黄芪甲苷对照品，加流动相制成每1ml含1mg的溶液作为皂苷类成分检测的对照品溶液。2)毛蕊异黄酮-7-O-D-吡喃葡萄糖苷对照品溶液的制备：取毛蕊异黄酮-7-O-D-吡喃葡萄糖苷对照品，加流动相制成每1ml含1mg的溶液作为黄酮及其苷类成分检测的对照品溶液。5、测定方法包括测定方法、仪器、试剂、测定条件等。应根据中

9、药材所含化学成分的理化性质，选择适宜的测定方法，建议优先考虑色谱方法。对于成分复杂的中药材，必要时可以考虑采用多种测定方法，建立多张对照指纹图谱。以色谱方法制定指纹图谱所采用的色谱柱、薄层板、试剂、测定条件等必须固定；以光谱方法制定指纹图谱，相应条件也必须固定。例：黄芪黄酮及其苷类成分的测定方法 照高效液相色谱法（中国药典2000年版一部附录D）测定。 色谱条件和系统适用性试验 色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，型号为Polaris 5 C-18-A，2504.6mm（MetaChem公司产品）；流动相为乙氰水（含0.042磷酸）(1:4)，流速0.8ml/分钟，检测波长225nm；理论塔

10、板数按毛蕊异黄酮-7-O-D-吡喃葡萄糖苷计，应不低于3000。 测定法 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10l，注入液相色谱仪中，记录60分钟的色谱图，即得。以毛蕊异黄酮-7-O-D-吡喃葡萄糖苷的色谱峰(S峰)的相对保留时间和峰面积为1计算相对保留时间和峰面积比值。6、指纹图谱及技术参数(1)指纹图谱根据供试品的检测结果，建立指纹图谱。采用HPLC和GC制定指纹图谱，其记录时间一般为1小时；采用TLCS制定指纹图谱，必须提供从原点至溶剂前沿的图谱；采用光谱法制定指纹图谱，必须按各种光谱的相应规定提供全谱。化学成分类型复杂的品种，必要时可建立多张对照指纹图谱。 指纹图谱的建立：根据10批

11、次以上供试品的检 测结果所给出的相关参数，制定指纹图谱。(2)共有指纹峰的标定采用色谱方法制定指纹图谱，必须根据参照物的保留时间，计算指纹峰的相对保留时间。根据10批次以上供试品的检测结果，标定中药材的共有指纹峰。色谱法采用相对保留时间标定指纹峰，光谱法采用波长或波数标定指纹峰。(3)共有指纹峰面积的比值以对照品作为参照物的指纹图谱，以参照物峰面积作为1，计算各共有指纹峰面积与参照物峰面积的比值；以内标物作为参照物的指纹图谱，则以共有指纹峰中其中一个峰（要求峰面积相对较大、较稳定的共有峰）的峰面积作为1，计算其他各共有指纹峰面积的比值。各共有指纹峰面积比值必须相对固定。峰面积比值的要求：Ai2

12、0At: SD2010%At AiAi 10At：SD25； 10 AtAi 5At：SD30； Ai5At：峰面积比值不作要求，但必须标定相对保留时间。保留时间超过30分钟的共有峰： Ai 10At：按上述规定执行； Ai 10At：峰面积比值不作要求，但必须标定相对保留时间。(4)非共有峰面积 供试品图谱与指纹图谱比较，非共有峰总面积不得大于总峰面积的5。(5)中药材、有效部位、中间体和注射剂指纹图谱之间的相关性可采用加入某一中药材、有效部位或中间体的供试品或制备某一中药材、有效部位或中间体阴性供试品的方法标定各指纹图谱之间的相关性。提供相关性研究的指纹图谱。(6)中试产品的指纹图谱申报临

13、床的中药注射剂必须提供三批以上中试产品的指纹图谱。申报生产的中药注射剂必须提供十批以上中试产品的指纹图谱。5、中药注射剂指纹图谱检测标准（草案）书写格式(1)供试品的制备(2)对照品溶液或内标物溶液的制备(3)测定方法（包括仪器、试剂、测定条件和测定方法）(4)指纹图谱及各项技术参数(5)起草说明(6)有效部位或中间体的指纹图谱检测标准及起草说明（二）指纹图谱的评价1. 指纹图谱的评价标准 供试品指纹图谱与该品种对照用指纹图谱（共有模式）之间的相似性。（1）指纹图谱的相似性应从两个方面考虑： A. 色谱的整体“面貌”，即有指纹意义的峰的数目、峰的位置和顺序、各峰之间的大致比例（TLC还有斑点颜

14、色）等是否相似，以判断样品的真实性。B. 供试品与对照样品或“对照用指纹图谱”之间及不同批次样品指纹图谱之间总积分值作量化比较 如总积分面积相差较大（如20%），则说明同样量的样品含有的内在物质有较明显的“量”的差异。 这种差异是否允许，应视具体品种、具体工艺的实际情况，并结合含量测定项目综合判断。（2）相似性比较 一般用“相似度”表达 药典会推荐的“中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件” 一般成品指纹图谱相似度计算结果在0.9 1.0（或以90 100表示）之间作为符合要求2.中药指纹图谱的计算机处理 中药的指纹图谱大都比较复杂，尤其是复方中药。如果用人工对其进行分析，找出其图谱特征并分析药

15、品质量，容易由于人的主观因素，造成结果的误差。中药的质量具有模糊性，图谱的相似性只有相对的意义。对于这种具有模糊性的问题，使用模糊分析显然比较合适。当前在指纹图谱分析方面，使用较多的为模糊聚类分析。主要分析计算方法有：A. 主成分分析（principle component analysis，PCA)B. 简单分类法（simple classification algorithm，SIMCA）C.非线性映照（nonlinear mapping，NLM）D.星座图技术（constellation-graphing technique）E.系统聚类分析（hierarchical clustering analysis）F.模糊聚类分析（fuzzy clustering analysis）G.向量夹角法H.人工神经网络识别（artificial neural net ，ANN）比较有发展前途的还有人工神经网络模式识别技术。与其他模式识别技术相比，人工神经网络模式识别具有下述4方面的优势：(1)较高的容错性能，能够识别带有噪声或变形的输入；(2)更强的自适应学习能力；(3)采用并