真核细胞RNA的制备和逆转录PCR-毛宇彬课件

1、实验五 真核细胞RNA的制备和Trizol 法提取组织或培养细胞总RNA 实验背景知识哺乳动物中，平均每个细胞大约含有10-5ugRNA。RNA的分子组成：rRNA（占RNA总量的80%85%），由28S、18S、5.85S及5S几类组成，它们之间同源性大、分子量变化不大，所以可根据它们的密度和分子大小，通过密度梯度离心，凝胶电泳或离子交换层析进行分离。tRNA和核内小分子RNA（占10%15%）mRNA（占1%5%）。 mRNA分子群体编码细胞内所有的多肽和蛋白质，因而是分子生物学中重要的研究对象。 mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，细胞中含量少，3端存在20230个多聚腺苷酸poly

2、(A)。利用此特征，可很方便地从总RNA中，用寡聚（dT）亲和层析柱分离mRNA。 RNA通常以单链形式存在，但也可形成局部的双螺旋结构。 RNA分子的种类较多，分子大小变化较大，功能多样化。RNA的种类、分布、功能一、实验目的和原理逆转录PCR（RT-PCR）是一种检测细胞及组织中特异性基因mRNA表达的实验室技术。在中心法则中，可以以mRNA为模板在逆转录酶的催化下合成cDNA。所获得的cDNA反映了结构基因的组成，可用于构建cDNA文库并进行基因的表达调控等研究。 RT-PCR扩增目的基因原理首先，以细胞或组织中分离的总RNA中的mRNA为模板，加入特异性3引物或多聚T锚定引物或随机引物

3、，在逆转录酶的作用下合成cDNA链；然后，以cDNA链为模板，由RNA依赖的DNA聚合酶催化合成相应互补的cDNA拷贝，后者能进一步用于PCR扩增。扩增特异的基因片段，通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分析，以代表该基因的mRNA水平表达情况。 分离纯净、完整的RNA对于分子克隆的实验是很重要的，而且是进行基因表达分析的基础。的成败很大程度上决定于RNA的质量。在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染，RNA酶很稳定，一般而言反应不需辅助因子，RNA酶是一类生物活性非常稳定的酶类，它耐热、耐酸、耐碱，蛋白质变性剂可使之暂时失活。

4、RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起严重的后果。 RNA分离的最关键因素是尽量避免RNA酶的污染。实验中所用到的全部溶液、玻璃器皿、塑料制品都需特别处理。一方面避免外源RNase的污染。要做到如下几点：操作戴口罩和手套；实验室保持洁净；玻璃器皿须用0.1%二乙基焦碳酸盐（DEPC）浸泡处理，并高压灭菌，250烘干4小时以上（高压不能完全灭活RNase）；所有溶液（除Tris外）须经DEPC浸泡处理；实验中所有塑料器材最好灭菌后一次性使用，所有化学试剂用新包装。另一方面排除内源RNase污染。内源RNase是由组织细胞中携带，细胞破碎后即释放出来。因而力争在提取的起始阶段对RNase活力进

5、行有效抑制，主要方法是使用RNase抑制剂，常用的有盐酸胍、异硫氰酸胍、RNase阻抑蛋白（RNasin）和氧钒核糖核苷复合物等。 所有分离提取RNA的方案的第一步操作都是在能导致RNA酶变性的化学环境中裂解细胞，然后才将RNA从各种生物大分子中分离出来。决定采用何种合适的制备方法，取决于RNA的细胞来源及其最终用途。本实验介绍从真核细胞中提取总RNA的通用方法，细胞用异硫氰酸胍裂解，此过程操作较少，从许多来源都能获得纯净的RNA，是从高内源性RNA酶的组织中提取RNA的首选方法。 PCR技术的产生和发展: .1971年Khorana于最早提出核酸体外扩增的设想 .1985年美国PE-Cetu

6、s公司人类遗传研究室的Mullis等发明PCR技术 .1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶,即Taq酶,该酶的发现使PCR广泛应用 .在引物指导下由酶催化的对特定的克隆或基因组DNA序列进行的扩增反应 PCR反应成分:1 DNA模板: .纯度要求不是很高,但不能含有影响扩增反应的物质 .模板DNA的量不要太多,过犹不及 .模板DNA制备过程中应防止样品间的交叉污染2引物: .浓度一般为0.1-0.5M .冻干引物-20至少可以保存12-24个月,液体状态-20 可保存6个月3Taq酶: .50l体系中酶用量0

7、.5-2.5U .激活剂与抑制剂PCR循环参数的设置:1变性: .95 变性20-30s即可使一般的DNA分子完全变性,对于富含G.C的模 板适当提高变性温度2退火: .温度一般为引物Tm-5 ,时间一般为20-40s,若模板含量少,可在前几个循环中适当延长退火时间,有利于引物与模板结合,提高反应灵敏度3延伸: .温度由所用的聚合酶决定,一般为70-75 ,延伸时间由扩增片段的长度决定,一般Taq酶延伸速率为60个碱基/s 150bp可省延伸步骤, 500bp 需20s, 500-1200bp 需40s 4循环次数: .一般为25-35次,在得到足够产物的前提下应尽量减少循环数二、实验材料组织

8、细胞：新鲜动物肝脏塑料制品： 尽可能使用无菌、一次性塑料制品，已标明 RNase-Free 的塑料制 品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。处理步骤如下： 1在玻璃烧杯中注入去离子水，加入 DEPC（焦碳酸二乙酯） 使 DEPC 的终浓度为 0.1%。注意：DEPC 为剧毒物，活性很强，小心在通 风柜中使用。2处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入 DEPC 水溶液， 使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。 3在通风柜中室温处理过夜。 4将 DEPC 水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住DEPC 水处理 过的塑料制品的烧杯，7080烘拷干燥

9、，高温高压蒸气灭菌至少 30 分钟。 5烘箱用合适的温度（7080）烘拷至干燥。置于干净处备用。 玻璃和金属物品：250 烘烤3小时以上或180烘烤8小时。 其它试剂：无水乙醇、氯仿 、DEPC处理过的水、75%乙醇（用DEPC处理水 配制）、0.5%（m/V）SDS（DEPC处理）三、方法和步骤1a：对于组织来源的材料：按50100mg组织样品加入1ml Trizol。组织体积不能超过Trizol体积的10，用匀浆器充分匀浆至透清。1b：对于培养的细胞：离心收集细胞后，弃上清，用移液管加Trizol反复吹打，裂解细胞至均一透亮的液态后，将匀浆样品在室温孵育5 分钟以使核蛋白体完全分解。每5-

10、10106的动物细胞加1ml的Trizol。2加入0.2 ml氯仿，振荡15秒，静置2min。34 离心，12000rpm10min，取上清。4加入0.5 ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。54 离心，12000 rpm10min，弃上清。6加入1ml 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀，4 离心，7500 rpm10min，取上清。7晾干，加入适量的DEPC水溶解（65 促溶1015min）。8总RNA定量及纯度检测： 取15 l RNA溶液于1.5%琼脂糖凝胶中电泳检测，没有降解的RNA电泳图18s、28s rRNA条带明显。 取5l样品稀释后测OD260、OD280，计算OD26

11、0/OD280。RNA纯品的比值为2.0，若比值较低，说明有残余蛋白质存在；比值太高，则提示RNA有降解。四、注意事项1此方法提取RNA A260/A280值在大于或等于1.8。 2组织或细胞量过少，可酌情减少Trizol用量；组织或细 胞用量过多，会引起DNA对RNA的污染；高蛋白、脂肪或多糖类组织，肌肉组织或块状植物组织等，组织匀浆或液氮研磨后须 4 12,000g离心 10min去掉不溶物，再进行下面操作，若顶层有脂肪物，则也须去掉。3RNA样品电泳检测时，如果18S rRNA、28S rRNA条带模糊不清，有以下两种情况：a样品量太多，造成分辨率下降，应适当稀释样品再泳。b样品操作时降

12、解，与器皿处理不严格、操作方法不严格、组织不新鲜有关。 逆转录PCR（RT-PCR） 二方法和步骤1. 逆转录（1）取一个200ul的EP管，加入1ug总RNA，加入以下反应物： Oligo-dT12-18 引物 1 l dNTP mixture 1 l DEPC 水 X 总体积为10 l（2）65 ，5min，迅速置冰2min以上。（3）离心数秒使模板RNA与引物聚集于管底。 （4）在上述管中加入以下试剂 5反应buffer 4 l RNase 抑制剂 0.5 l 逆转录酶 0.5 l DEPC 水 5 l 总体积20ul（5）混匀后置于42 ，60min。（6）置于70 ，15min后冰上

13、冷却。（7）测定cDNA产物的浓度： 取5ul样品稀释后测OD260、OD280，计算 OD260/OD280，纯品cDNA比值为1.8。（3）在PCR仪上按以下反应程序进行PCR循环反应。 反应程序：第一步：95C 2min 第二步：95C 30s 第三步：56C 45s 30循环 第四步：72C 45s 第五步：72C 10min 第六步：4C 2h（4）取10ul反应液加入2 l 6loading buffer 进行1琼脂糖凝胶电泳（5）在凝胶成像系统上观察记录实验结果，判断PCR扩增产物分子量是否与理论一直。-actin目的片段理论大小为约400bp左右。 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.250kb之间 四思考题1RNA的分离提取和RNA样品的保存过程中如何防止RNA降解？2如何判断提取的染色体DNA样品的质量？ 3、简述mRNA逆转录的基本原理。4、PCR的基本原理。5、PCR反应产物中出现非特异条带的原因是什么？如何克服？附：各种组织细胞RNA产量Hela cells 1.6mg/108cellsMouse intestine 2.3mg/g组织Mouse spleen 8.3mg/g组织Mouse l