人骨髓间充质干细胞体外支持脐血CD34+细胞增殖的研究

1、人骨髓间充质干细胞体外支持脐血CD34+细胞增殖的研究马俐君，高磊，周虹，邱慧颖，胡晓霞，解琳娜，王健民【摘要】为了研究人骨髓间充质干细胞S作为滋养层细胞体外支持脐血D34+细胞扩增的作用，将S和胎儿骨髓泉源的成纤维细胞样骨髓基质细胞系HFL经60线照耀后别离制备细胞滋养层，比力差异滋养层细胞和添加或不加细胞因子对脐血D34+细胞增殖数及LT-I数的影响。效果表白，无论有无添加细胞因子(rhFL、rhSF、rhTP)，HFL滋养层组造就12天扩增细胞数显着高于S滋养层组，以第0天细胞数为100%下同，有细胞因子组为(9797361%vs(7061418%，无细胞因子组为(5305354)%vs

2、(1992247)%，均P0.01。S滋养层组D34+细胞扩增数与HFL滋养层组比拟无明显差异825305%vs(820191)%，P0.05，但在细胞因子存在时低于HFL滋养层组939212%vs(1617222)%，P0.01。S滋养层组维持脐血中LT-I的本领显着优于HFL滋养层组第5周FU-G数129.958.73个/105接种细胞数vs89.8110.29个/105接种细胞数，P0.05；细胞因子存在时，其作用更为显着第5周FU-G数192.934.95个/105接种细胞数vs90.4714.28个/105接种细胞数，P0.01。S与HFL按必然比例混淆，可进步扩增服从。当S与HFL

3、之比为41时，集落形成数目最高，达186.8911.11个/105接种细胞数，显着高于比例为32131.4513.02个/105接种细胞数和二者单用组前者138.9214.84个/105接种细胞数，后者64.636.11个/105接种细胞数；均P0.01。结论:S维持脐血中LT-I集落形成的本领优于基质细胞系HFL，HFL支持脐血D34+细胞的增殖本领优于S，S加上适量HFL可明显进步D34+细胞扩增服从。【关键词】间充质干细胞；脐血D34细胞；D34+细胞扩增EffetsfHuanesenhyalSteellsandFibrblastidellLineasFeederLayersnExpan

4、sinfUbilialrdBldD34+ellsInVitrKeyrdsesenhyalsteell；rdbldD34+ell；D34+ellexpansin体内的稳态造血依靠于庞大而完备的骨髓造血微环境，人骨髓间充质干细胞esenhyalsteell,S是成纤维细胞、血管内皮细胞、巨噬细胞、脂肪细胞等多种骨髓造血微环境的紧张构成细胞的前体细胞，在造血调控中起着关键的作用。有实行和临床研究证明，S与造血干/祖细胞HSP共移植可促进移植后造血重修，然而详细机理如今尚无定论。明白S体外支持造血的作用对付进一步研究S在造血干细胞移植中的作用及进步S的服从具有紧张意义。为此我们举行了从体外到动物体内的

5、系列研究。本研究报道在创立了成人骨髓S的大范围分散造就要领的底子上，通过比力S与早前创立的有明白体外支持造血作用的骨髓成纤维细胞样基质细胞系(huanfibrblastidellline,HFL)作为滋养层细胞体外支持脐血D34+细胞扩增的差异，明白S体外支持造血细胞增殖的本领，为进一步开展体内支持造血的研究提供实行根据。质料和要领细胞造就胎儿泉源的成纤维细胞样人骨髓基质细胞系HFL由中国医学科学院血液学研究所姜学英建系，本室保存1。人骨髓间充质干细胞为清醒后的P3代冻存细胞网罗康健志愿者骨髓液，分散S并体外造就，流式细胞术检测各代细胞外貌标记为D34、D45、D14，D80(B7-1)、D8

6、6(B7-2)、D40、D40L(D154)和HLA-DR阴性，D29、D44、D90、D105和D166阳性，体外可以或许诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞，详细数据另文颁发。S造就基为含10%FBS为主的低糖DE。D34+细胞造就体系为ID中含15%HS、15%FBS、510-5l/L氢化可的松、4l/LL-谷氨酰胺。恒久造就起始细胞lng-terulture-initiatingells，LT-I造就体系yelultH5100和FU-G甲基纤维素造就基为加拿大SteellTeh产物。重组人Flt-3配体rhFL)、重组人干细胞因子rhSF、重组人血小板生长因子rhTP等均为Siga公

7、司产物。脐血D34+细胞的分散纯化S与HFL支持脐血D34+细胞增殖作用的比力制备细胞滋养层将体外造就扩增的P3代S和基质细胞系HFL按1-5105个/孔的浓度接种于24孔、12孔或6孔造就板上，细胞呈单层完全贴壁后，60线照耀1500Gy，20Gy/in，照耀后原条件造就24小时后弃造就液，换用相应造就体系举行后续实行。实行分组按照滋养层细胞差异和是否添加细胞因子将实行分为6组：比拟组：无细胞因子无滋养层；组：单加细胞因子；H组：骨髓基质细胞系HFL；H+组：HFL+细胞因子；S组：S；S+组：S+细胞因子。细胞因子为：50ng/lrhFL、50ng/lrhSF和20ng/lrhTP。支持脐

8、血D34+细胞扩增的作用滋养层每组设3个复孔，共18孔。每孔接种前述脐血D34+细胞悬液1l1104/l造就，隔日半量换液1次。12天后别离网络各孔全部悬浮及贴壁细胞0.05%胰酶消化，300g室温离心5分钟后以S造就液重悬，别离转移至新的6孔板中，静止造就3小时，网络悬浮细胞，离心后PBS重悬，取样计数活细胞，并用流式细胞术检测D34+细胞数。D34+细胞增殖率PR=(扩增后细胞总数扩增后D34+细胞比例/接种细胞数96.36%)100滋养细胞体外维持LT-I的作用2将D34+细胞按5104/孔的浓度接种于制备好的含或不含细胞滋养层的12孔板中同实行分组，置于LT-I造就体系、52、33、饱

9、和湿度下一连造就68周，每周半量换液1次，每次细胞取出后，按雷同细胞数参加FU-G集落造就液，别离举行2周的集落造就，光学显微镜下按计数细胞数40的无色细胞团即为FU-G集落数，计数FU-G集落数。差异比例S和HFL维持LT-I的作用将S与HFL按差异比例混淆接种6孔板制备滋养层，细胞总数为5105/孔表1，同前照耀后接种D34+细胞4104/孔。每组3个复孔，置于LT-I造就体系中，于52、33、饱和湿度下一连造就5周，每周半量换液1次。第5周后劳绩全部细胞，同前要领参加FU-G集落造就基，造就2周后计数FU-G集落数。Table1.PrprtinandellnubersfSandHFLin

10、aintainingLT-Iulturesyste略统计学处置惩罚应用SPSS医用统计软件包，接纳卡方查验，配对样本t查验和单因素方差阐发，举行数据统计学处置惩罚。P0.05为差异明显，P0.01差异非常明显。效果免疫磁珠分散纯化可得到高纯度的D34+造血干/祖细胞经FAS检测，AS磁性分散试剂盒分散的脐血D34+细胞纯度为96.36。经尾静脉输注给ND/SID小鼠，可以或许重修人类淋巴和髓系的造血细胞相干资料另文颁发。在细胞因子的协同作用下，基质细胞系HFL支持人脐血D34+干/祖细胞增殖的作用显着强于S人脐血D34+细胞在差异滋养层和液体造就体系下举行体外造就12天后，细胞总数和D34+细

11、胞数的增长环境见图1。人脐血D34+细胞在HFL滋养层细胞因子组的扩增数目最高，细胞总数增长至接种细胞数下同的9797361%，高于S滋养层细胞因子组的7061418%及别的各组P0.01(图1a)；D34+细胞增长至1617222%，也显着高于S滋养层细胞因子组的939212%及别的各组均P0.01(图1b)。单纯HFL滋养层组细胞总数扩增至5305354%，显着高于单纯S滋养层组的(1992247)%和细胞因子组的2383347%。单纯HFL滋养层组D34+细胞扩增至825305%，和S滋养层组82191%比拟无明显统计学差异，但显着高于单用细胞因子组44461%。S维持脐血中LT-I的本

12、领优于基质细胞系HFL，有细胞因子协同时更为显着比力加或不加细胞因子的环境下差异滋养层的恒久造就体系中每周的G-FU集落形成数，明白S是否具有维持LT-I的作用。效果创造，有细胞滋养层组，无论是否添加细胞因子，在第1-8周均可见集落形成，但除第1周外，每个时间点，含S滋养层组显着高于含HFL滋养层组第5周FU-G集落数129.958.73个/105接种细胞数vs89.8110.29个/105接种细胞数(P0.05；HFL滋养层组无论有否细胞因子，自第3周后各个时间点集落形成数无显着差异P0.05；含细胞因子的S滋养层组各个时间点集落形成数都高于单纯S滋养层组第5周FU-G集落数192.934.

13、95个/105接种细胞数vs90.4714.28个/105接种细胞数(P0.01。细胞因子组在第2-3周集落数明显落落，至第5周末见集落生长。单纯D34细胞组第2周后即未见有集落形成图2。这一效果说明S体外恒久维持D34+细胞LT-I的本领显着优于基质细胞，尤其在有细胞因子的环境下，其作用更为显着。S与HFL得当比例混淆，体外支持脐血D34+细胞生长的作用更佳从图3中看出，S与基质细胞配互助为滋养层，单纯S对D34+细胞的体外支持造血作用优于单纯HFL，切合前述实行效果。这种支持作用在S所占比例凌驾1/4后有明显加强(P0.012)，并在S与HFL比例为41时到达岑岭，集落形成数目为186.8

14、911.11个/105接种细胞数，显着高于二者比例为32组的131.4513.02个/105接种细胞数和单纯S组的138.9214.84个/105接种细胞数P0.005)。讨论20世纪70年代初FriedenstEin3起首提出了造血诱导微环境(heatpietiindutiveirenvirent，HIE)的看法。骨髓基质细胞、细胞外基质和细胞因子是HIE的紧张构成部门，此中基质细胞因是排泄基质与细胞因子的主体而成为支持造血的关键环节。担当HS移植者因放、化疗导致骨髓基质损伤，这大大地减弱了移植后造血重修。Galtt等4将HS移植后受者成纤维细胞集落形成单元lny-fringunitsfib

15、rblast；FU-F与正常供体FU-F比拟力，创造HS移植受者骨髓FU-F集落数低落了60%-90%P0.05，5岁以上受体移植后12年FU-F集落数仍不克不及规复正常，而且低程度FU-F患者的骨密度低落，恒久造就起始细胞lng-terulture-initiatingells；LT-I也显着淘汰。修复和更换由遗传突变或外来因素造成的基质损伤可促进造血4，5。动物实行表白，来自康健供者的基质细胞与HS共移植既可改进HS植入率又可加速造血规复。Aleida-Prada等6将成年羊基质细胞与HS共移植给胎羊，移植后HS植入增长，造血明显加强达30月余。体外造就中，纵然是单一基质细胞作为滋养层也可

16、以或许促进D34+细胞增殖，同时维持其干细胞特性，便如可使LT-I数目比单用多种细胞因子组合者增长3-5倍1，7，8。骨髓S是骨髓种种基质细胞的前体细胞，据推测同骨髓基质细胞一样具有促进D34+细胞增殖、分化和维持LT-I本领。ang等9和Bensidhu等10先后报道，用骨髓S作滋养层可举行大要积的人脐血泉源的HS短期扩增，动物实行中S可以或许促进人脐血泉源的D34+在ND/SID体内的植入。ajudar等2创造，以骨髓S作滋养层的扩增体系可显着扩增人骨髓D34+细胞和小鼠的HS中的LT-I。然而，S自己即具备干细胞特性，它与一样平常的基质细胞系比拟，是否对造血干/祖细胞的扩增作用更佳？国表

17、里报道很少，且没有告竣同等不雅点。我们以造就扩增的人骨髓S为滋养层，以泉源于胎儿骨髓的已证明具有体外支持造血作用的成纤维细胞样基质细胞系HFL滋养层作比拟1，不雅察S对脐血D34+细胞的增殖作用，尤其是维持LT-I形成FU-G的本领，为体外扩增D34+细胞的研究和后续动物体内实行奠基基矗本研究起首通过实行确定了既制止滋养细胞增殖又不影响其存活的最正确照耀剂量。效果表白，以较低剂量率20Gy/in、1500Gy线照耀S和HFL后未见细胞脱落，造就1周后无显着增殖亦未见朽迈和死细胞出现，到达预期的制备滋养层目的资料未表现。实行效果表现，在细胞因子存在的环境下，D34+细胞在差异滋养层上造就12天后

18、，扩增细胞数目显着差异，HFL滋养层组的扩增数目最高，细胞总数增长至9797361%，显着高于S滋养层组的7061418%及别的各组均P0.01；在没有细胞因子存在时，HFL滋养层组扩增细胞数至5305354%，也显着高于S滋养层组的(1992247)%和细胞因子组的2383347%，但较有细胞因子S滋养层组低P0.01，这说明HFL支持脐血D34细胞的增殖本领优于S，在细胞因子协同作用下，增殖作用越发显着，D34+细胞也增长至1617222%，显着高于S滋养层组的939212%及别的各组均P0.01。不雅察S体外维持脐血D34+细胞LT-I的本领，含S滋养层组在第28周FU-G显着高于含HFL滋养层组均P0.01；含细胞因子的S滋养层组各个时间点集落形成数又都高于单纯S滋养层组P0.05。该效果与Kzik等11和Biret等12报道的效果相近，说明S体外恒久维持脐血中LT-I的本领显着优于单一的成纤维细胞样基质细胞，尤其在有细胞因子的环境下，其作用更为显着。进一步研究创造，将S与HFL以结实细胞总数混互助为滋养层，随着S所占比例凌驾1/5，其支持D34+形成的G-FU数目也有明显增长。特殊是当S与HFL的比例为41时，G-FU形成数目最高，高于单纯S滋养层组。总之，S维持恒久造血重修的本领强于单一的成纤维细胞样骨髓基质细胞系HFL，并与必然比例的HFL有