初始污染菌检测讲义课件

1、关于初始污染菌检测讲义2008年5月1第1页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四微 生 物 基 础 知 识微生物基础知识无菌技术初始污染菌检测关键步骤致病菌检查2008年5月2第2页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四微生物学检查无菌检查微生物限度检查细菌、真菌数量控制菌其他（初始污染菌） 2008年5月3第3页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四 微 生 物 基 础 知 识 微生物与微生物学 自然界中存在着一个数量极其庞大、个体微小和结构简单的生物类群，即微生物。微生物大多数为单细胞，必须借助光学显微镜放大千倍或电子显微镜放大数万倍才能肉

2、眼可见的一类微小生物的统称。 微生物学是研究微生物的形态结构、分类、生理代谢、遗传变异、生态分布和微生物与人类、动植物关系等的一门学科。我们对微生物深入研究的目的在于更好地开发微生物资源，充分利用微生物有利于人类生活方面。控制微生物的有害方面，使之更好地为人类服务。 2008年5月4第4页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四微 生 物 的 分 类微生物非细胞型微生物原核细胞型微生物真核细胞型微生物病毒亚病毒因子细菌放线菌衣原体 支原体等真菌原生生物2008年5月5第5页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四细 菌 形 态 特 征细菌个体形态 细菌是一类细胞细而

3、短（细胞直径约0.5m,0.5-5m）、结构简单、细胞壁坚韧以二等分裂方式繁殖和水生性较强的原核微生物，分布广泛。 形态图细菌菌落形态 单个或少数细菌细胞生长繁殖后，会形成以母细胞为中心的一堆肉眼可见、有一定形态构造的子细胞集团，这就是菌落。细菌菌落常表现为湿润、粘稠、光滑、较透明、易挑取、质地均匀以及菌落正反面或边缘与中央部位颜色一致等。细菌的菌落特征因种而异。 可作为鉴定细菌种的依据。 菌落图2008年5月6第6页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四细 菌 形 态 特 征2008年5月7第7页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四细 菌 形 态 特 征粘质

4、沙雷氏菌的菌落特征 2008年5月8第8页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四细 菌 形 态 特 征铜绿假单孢菌的菌落特征 2008年5月9第9页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四细 菌 形 态 特 征金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37C，最适生长pH 7.4。平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1-2mm。血平板菌落周围形成透明的溶血环。2008年5月10第10页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四细 菌 形 态 特 征金黄色葡萄球菌的单个菌落在Baird-Parker琼脂平板上呈圆形,

5、表面光滑、凸起、湿 润,直径23mm。灰黑色至黑色,有光泽,常有浅色(非白色)的边缘,周围绕以不透明圈 (沉淀),其外常有一清晰带。当用接种针触及菌落时具有黄油样粘稠感。2008年5月11第11页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四细 菌 形 态 特 征 描 述大小：直径形状：圆形、假根形、不规则型隆起形状：扩展、苔状、低凸、凸面、乳头状边缘：整齐、波状、裂叶状、圆锯齿状、有缘毛表面状态：光滑、皱褶、颗粒状、龟裂状、同心环状表面光泽：闪光、不闪光、金属光泽质地：油脂状、膜状、脆透明程度：不透明、半透明 细菌菌落的常规描述2008年5月12第12页，共78页，2022年，5月2

6、0日，12点2分，星期四细 菌 形 态 特 征细菌基本结构荚 膜细胞壁胞浆膜核 蛋 白核 质2008年5月13第13页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四细 菌 形 态 特 征革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的细胞壁结构比较细胞壁结构GG厚度2080nm1015nm强度坚韧疏松糖类含量约45约15脂类含量约2约20磷壁酸无有脂多糖无有脂多糖（LPS）,包括脂蛋白A，核心多糖和特异性多糖三个部分。LPS对动物具有毒性作用，它牢固地结合在细胞表面，只在菌体融解时才释放，称为细菌内毒素。其中脂蛋白A是内毒素的主要生物学活性组分。2008年5月14第14页，共78页，2022年，5月2

7、0日，12点2分，星期四真 菌 形 态 特 征霉菌个体形态 霉菌亦称丝状真菌，是在分类学上很不相同的许多真菌的一部分，凡是生长在营养基质上形成绒毛状、蜘蛛网状或絮状菌丝体的真菌，统称为霉菌，霉菌为真核微生物，其结构比细菌复杂。酵母菌个体形态 酵母菌是单细胞真核微生物。酵母菌细胞的形态通常有球形、卵圆形、腊肠形、椭圆形、柠檬形或藕节形等。比细菌的单细胞个体要大得多，一般为15微米530微米。酵母菌无鞭毛，不能游动。酵母菌具有典型的真核细胞结构,有细胞壁、细胞膜、细胞核、细胞质、液泡、线粒体等，有的还具有微体。2008年5月15第15页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四霉 菌

8、形 态 特 征 由于霉菌的菌丝较粗而长，因而霉菌的菌落较大，有的霉菌的菌丝蔓延，没有局限性，其菌落可扩展到整个培养皿，有的种则有一定的局限性，直径12厘米或更小。菌落质地一般比放线菌疏松，外观干燥，不透明，呈现或紧或松的蛛网状、绒毛状或棉絮状；菌落与培养基的连接紧密，不易挑取；菌落正反面的颜色和边缘与中心的颜色常不一致。 2008年5月16第16页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四酵 母 菌 形 态 特 征啤酒酵母的菌落 大多数酵母菌的菌落特征与细菌相似，但比细菌菌落大而厚，菌落表面光滑、湿润、粘稠，容易挑起，菌落质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色都很均一，菌落多为乳白

9、色，少数为红色，个别为黑色。 2008年5月17第17页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四微 生 物 群 体 生 长 规 律 将少量单细胞纯培养接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养，定时取样测定其细菌含量，可以看到以下现象：开始有一短暂时间，细菌数量并不增加，随之细菌数目增加很快，既而细菌数又趋稳定，最后逐渐下降。如果以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速度为纵坐标作图，可以得到一条曲线，称为繁殖曲线，通常又称为生长曲线。生长曲线代表了细菌在新的适宜的环境中生长繁殖直至衰老死亡全过程的动态变化。根据细菌生长繁殖速率的不同，可将生长曲线大致分为延迟期、

10、对数期、稳定期和衰亡期四个阶段。 规律的描述规律示意图2008年5月18第18页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四微 生 物 群 体 生 长 规 律延迟期：少量细菌接种到新鲜培养基后，一般不立即进行 繁殖，生长速度近于零。处于延迟期细菌细胞的特点是分裂迟缓、代谢活跃。对数期：对数期又称指数期。这一阶段突 出特点是细菌数以几何级数增加， 代时稳定，细菌数目的增加与原生 质总量的增加，与菌液混浊度的增 加均呈正相关性。 稳定期：又称恒定期或最高生长期。处于稳定期 的微生物，新增殖的细胞数与老细胞的 死亡数几乎相等，整个培养物中二者处 于动态平衡，此时生长速度又逐渐趋向 零。 衰

11、亡期：稳定期后如再继续培养，细菌死亡率逐渐增加，以致死亡数大大超过新生数，群体中活菌数目急剧下降，出现了“负生长”，此阶段叫衰亡期。 2008年5月19第19页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四微生物操作技术无菌环境是前提！ 主要是指在微生物实验工作中，控制或防止各类微生物的 污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施，其中包括无菌环境设施、无菌实验器材等，统称为无菌技术。 无菌环境的 应用是一个完整的操作技术体系。若其中的任何一个环节污染，那么其他环节虽是无菌操作，也将完全失去意义。无菌技术概念无菌环境 无菌环境是指人们用物理的或化学的方法，在某一可控的空间内使微生物数量降低

12、到最低限度，接近于无菌的一种空间。2008年5月20第20页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四试验环境的要求及无菌操作环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的 单向流空气区域内进行。阳性实验室、检查间分离。严格按无菌操作,防止实验室的培养物被其他外来微生物污染；避免操作者自身被微生物感染。 无菌操作在有洁净级别的实验室中进行，与试验相关的金属器械、玻璃器皿、稀释剂等应经过灭菌处理；其他的材料应经过表面消毒、紫外线照射消毒后，再带入实验室 。2008年5月21第21页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四无 菌 技 术技术培训和考核制度仪器和试剂的校对制

13、度实验记录制度结果质疑和核对制度技术方法的规范制度 实验室安全制度安全通则生物安全微生物检验质量控制制度2008年5月22第22页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四无 菌 技术菌 种菌种保藏原理 保藏的原则是根据微生物的菌种生理、生化特性，在人工创造的条件下尽量降低微生物细胞的代谢强度，使细胞基本上处于休眠状态，生长繁殖受到抑制但又不至于死亡，以降低菌种的变异率。菌种保藏步骤选择典型菌落确定菌体形态选择保藏方法定期检查方法主要原理适用的微生物包藏时间特点琼脂斜面低温保藏法低温（4）广泛16个月简便液体石蜡保藏法低温，缺氧广泛1年以上简便干燥（砂土）保藏法干燥，无营养产孢微生

14、物110年简便有效冷冻真空干燥法干燥，缺氧、低温广泛5 10年复杂但有效液氮超低温保藏法超低温广泛数十年复杂但有效菌种保藏方法2008年5月23第23页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四无 菌 技 术琼脂斜面低温保存法方法适用范围特点注意事项 将经常使用的菌种的典型菌落接种在斜面上，按规定的温度和时间培养，待充分生长后，把培养好的新鲜菌种管用牛皮纸包好，4度冰箱保藏。每隔1个月移种一次，继续进行保藏。 本法适用与经常使用的细菌、酵母菌等。（1）优点：简便，易推广；一般不需要另选则保藏用培养基；对大多数 都适用。（2）缺点：保藏期短；传代次数多，易变异和污染。 （1）保藏菌种

15、的选择。（2）定期检查。 （3）做好记录。 2008年5月24第24页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四无 菌 技 术半固体石蜡保存法方法适用范围特点注意事项 用石蜡让培养物与空气隔绝，以降低菌种的生理生化水平，并可防止水分蒸发，从而延长菌种的保藏时间。 本法适用与部分霉菌、酵母菌和放线菌等，对细菌的效果较差。（1）优点：简便，易推广。（1）液体石蜡的高度。（2）定期检查。 （3）做好记录。 2008年5月25第25页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四无 菌 技 术斜面培养基接种技术方法左手持分离培养的平板培养基，右手持接种环，经火焰烧灼，冷却后在平板上

16、挑取菌落。左手立即放下平板，换持斜面培养基，用右手小指和无名指拔出管塞，夹持于手指之间。将管口在火焰上通过两三次，但勿烧烫。再迅速将挑取有菌的接种环伸进斜面内，从斜面的底部向上划一条接种线，又自下而上蜿蜒接种成曲线。退出接种环，塞上管塞。接种环经火焰灭菌后放置。培养后，沿接种线长出菌苔，非接种线的部位应无细菌生长。2008年5月26第26页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四无 菌 技 术分离技术划线分离法分段划线法组段间接种环的灭菌、冷却！2008年5月27第27页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四无 菌 技 术金黄色葡萄球菌的保藏一般为冻干粉剂，安瓿瓶

17、密封包装。选择性培养基分离菌种。增菌性培养选择性培养基分离菌种。斜面接种、培养低温保藏2008年5月28第28页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四无 菌 技 术无菌器材实验器材灭菌器材消毒器材凡是检验中使用的器材，能灭菌处理的，必须灭菌处理。如：玻璃器皿、吸管、培养基、稀释剂、无菌衣、口罩等，在使用前必须经过适当方法灭菌，并在较洁净的环境中保存备用。凡检验用器材无法灭菌处理的，使用前必须经消毒处理。如：无菌室的桌凳、天平、工作台以及工作人员的手等。2008年5月29第29页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四无 菌 技 术无菌操作基本概念：无菌操作一般是指

18、在无菌环境条件下，使用无菌制品或无 菌器材进行检验或实验的过程中， 能防止微生物污染与干 扰的一种常规操作方法。操作目的：（1）保证检验物品不被环境中的微生物的污染； （2）防止被检微生物在操作中污染实验人员和实验环境。主要方面：（1）实验前的准备 （2）实验中的操作 （3）意外事故的处理2008年5月30第30页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四无 菌 技 术进入无菌室的控制1、定期检查无菌环境的空气是否符合规定；2、无菌室在使用前开启紫外线灯3060min进行空气消毒；3、在进行接种倾注琼脂平板均需在无菌室超净工作台或接种罩内操作3、检查一切进入无菌环境的器材灭菌、消毒

19、的标志物是否完备；4、洗手消毒：首先用肥皂涂在手上揉搓1015s，肥皂虽不杀菌， 有去污作用，然后用流水彻底冲洗，可有效除去手上大多数暂 住菌，如连续洗23次(视手的污染程度)，使残余的微生物减 少到最低水平，再用消毒液洗手，如洗必泰、苯扎溴铵、碘 伏、乙醇、过氧乙酸等。5、操作人员将手部消毒后，再穿戴无菌工作服(包括鞋、帽、口罩 等)。严格的无菌服应是戴帽套头的无扣的上衣，颈部、脸部及 袖口是紧口的，以保护身体，防止污染。一般的无菌衣是背开 口，围胸部、紧扣颈部与长袖紧口的，以保护身体，防止污染。6、在进入无菌室后，进一步用浸有消毒液的棉球或泡沫塑料物消 毒手，然后可进行检验或实验操作。20

20、08年5月31第31页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四无 菌 技 术检验过程的控制1、在所有操作中均不应大幅度或快速动作，以免搅动空气中尘 埃微粒。2、使用玻璃器皿应轻取轻放，避免破损，以防培养物扩散。3、在近火焰区操作。4、使用金属接种器具、用前、用后均需燃烧灭菌。5、应用橡胶乳头套在吸管上端，吸吹供试液或培养液等，切勿 用嘴直接吸吹吸管。6、用注射器吸取样品、培养物时，注射器内应无空气；装卸针 头时应用灭菌的镊子；从密封容器内抽取液体时，应注入无 菌空气；带液体的针筒针头应向上倾斜，并用75%乙醇棉球 (挤干)保护针头根部；注射时勿用力过猛，以免内容物喷出 或针头脱落

21、使溢出液体污染灭菌器材或环境。7、当灭菌瓶塞或试管塞掉落在工作台上，一般不宜再用，应另 换无菌塞，或通过火焰处理后再用。2008年5月32第32页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四无 菌 技 术意外事故的控制1、假定无菌衣受污染，应脱下翻转包裹，使污染部分包在 内部，送往消毒，经灭菌后，洗涤再用。2、因偶然打破盛有培养物的器皿，致使病原性的菌毒种外 溢，污染了工作室及操作者的衣物及体表时，当事人应 冷静，切勿乱动以免扩大污染面。应唤他人用浸透消毒 液的毛巾或纱布覆盖于碎片上，或将消毒液倒在污染 区，浸没一定时间。先从外至内逐步清理污染源，最后 将衣物彻底灭菌。清理时应避免用

22、手指收集玻璃碎片， 以防污染皮肤，造成病原性微生物感染事故。3、对一般小面积的污染可自行处理，较大范围的污染则请 人协助。2008年5月33第33页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四消 毒 灭 菌 技 术消毒disinfection消毒基本概念：消毒是杀灭清除传播媒介上病原微生物。但不能杀死 芽孢等全部微生物。所以消毒是不彻底的，不能代替灭菌。消毒方法：见下页灭菌sterilization灭菌基本概念：凡能杀灭物体中所有活的微生物的作用称为灭菌。常用灭菌方法：湿热灭菌法、干热灭菌法、辐射灭菌法、气体灭菌法等。2008年5月34第34页，共78页，2022年，5月20日，12

23、点2分，星期四消 毒 灭 菌 技 术消毒剂消毒原理常用浓度备注乙醇 蛋白质变性、溶解细胞 70%75% 能迅速杀死细菌繁殖体，对一般病毒有一定的消毒作用。一般用95%乙醇稀释成70%75%的乙醇溶液，常用于皮肤消毒。市售或自配的75%乙醇并非无菌 洗必太 0.1%0.5%消毒器械，0.05%用于皮肤、黏膜和冲洗伤口。难溶于水，常制成葡萄糖酸盐、盐酸盐、醋酸盐使用，对革兰阳性菌、阴性菌均有杀菌作用，但对前者作用较强。0.5%的洗必太与70%的乙醇混合用，比单一用一种杀菌效果好。不能与肥皂、洗衣粉、其他阴离子物质、升汞合用 过氧乙酸 蛋白质沉淀 0.5%皮肤消毒 广谱消毒剂。能杀死细菌繁殖体、芽孢

24、、 真菌与某些病毒，对空气、皮肤和食品消毒常用，0.2%0.5%用于塑料、织物、等消毒；用1g/m3熏蒸，过氧乙酸产生的蒸汽，对空气的消毒效果很好。 碘伏 卤化作用市售碘伏为0.75%、10%、7.5%、5%、1% 广谱杀菌剂，对革兰阳性、阴性菌类、炭疽芽孢菌均有杀灭作用。 来苏(甲酚肥皂液) 损伤细胞膜 2% 2%水溶液可用于皮肤消毒 来苏比苯酚的杀菌作用强，有毒性，消毒手后有麻木感 2008年5月35第35页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四消 毒 灭 菌 技 术仪 器准备和包装灭菌方法时间湿度()滤器用洗碟机清洗，分别放在不锈钢小车上高压灭菌40min121擦净剂用棕

25、色纸包在原包装上高压灭菌40min121金属试管架放在不锈钢小车上高压灭菌40min121镊子、刮刀插在试管里，塞塞子，放入玻璃纸信封，封口烘箱干热灭菌高压灭菌4h不少于15min205121吸管(移液管)用清洁器清洗，烘干，分别放入金属筒中烘箱干热灭菌4h205烧杯清洗，用箔封口烘箱干热灭菌4h20510ml、20ml带螺旋帽的小瓶置不锈钢小车上高压灭菌不少于15min1210.45m微孔滤膜的滤器按原包装或从原包装移去滤器置玻璃培养皿内高压灭菌15min1212008年5月36第36页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四培 养 基 的 基 础 知 识培养基水分炭源氮源无机

26、盐类生长因子凝固剂其他培养基的概念培养基是人工配制的生物营养物质，即用人工的方法将多种物质按各种微生物生长繁殖的需要配成的一种混合营养物。培养基的主要成份培养基的分类培养基形态用途成份固体培养基半固体培养基液体培养基基础培养基增菌培养基选择培养基等天然培养基合成培养基2008年5月37第37页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四培 养 基 的 基 础 知 识培养基制备常用仪器的准备平皿用纸或者布包好，或装在金属盒内，于121高压蒸汽灭菌20min后烘干。试管试管管口用棉花塞或硅氟塑料试管塞塞好，用布或报纸包好，于121高压蒸汽灭菌20min后烘干。移液管先用少许棉花塞于吸口端

27、，然后用纸包好或装入金属吸管筒内，于121高压蒸汽灭菌20min后烘干。2008年5月38第38页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四培 养 基 的 基 础 知 识培养基制备 溶 化校正酸碱度热 过 滤 分 装 灭 菌（1）先将卵磷脂加入少量蒸馏水低温加热溶解溶、再加吐温80混匀，加入琼脂，静置15分钟。高压灭菌前培养基的pH可比最终pH值调高0.2左右，灭菌后基本合适。营养琼脂：调PH7.1-7.4营养琼脂一般采用121、103.42kPa蒸汽灭菌30min。液体培养基用滤纸过滤，固体培养基用纱布块中夹薄层脱脂棉过滤2008年5月39第39页，共78页，2022年，5月20

28、日，12点2分，星期四细 菌 计 数基本概念 细菌数测定是微生物的定量检查，对非规定灭菌产品中污染的活菌数量进行测定，通常以每克或每毫升供试品作为计量单位。限制条件 平板菌落计数法的特点是先使细胞分散、定位，增生可见菌落后计数。它是一种有条件的计数法，其限制条件大致如下：以菌落数为基础。 CFU(colony forming units):一个菌落就是一个细菌形成单位，它 可以由一个也可以由多个菌细胞形成。受特定培养基和培养条件限制。有繁殖能力的菌细胞才能认定“活菌”。2008年5月40第40页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四初始污染菌检测初始污染菌检测：目前使用标准GB

29、 15980（一次性使用医疗卫生标准）。本标规定了一次性使用医疗用品灭菌、消毒前、后的卫生标准。本标准对一次性使用医疗用品（包括灭菌的和消毒的一次性使用医疗用品）生产、装配，包装车间等生产过程和生产工人手提出卫生的质量控制。引用标准：GB7918.2、GB8368、GB8369、中华人民共和国药典。2008年5月41第41页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四初始污染菌检测指标含义测定检品细菌总数可用来判明检品细菌污染的程度，以及生产单位所用的原料、工具设备、工艺流程、生产人员的卫生状况，是对检品进行卫生学评价的综合依据。方法主要步骤采样供试液制备培养菌落计数2008年5月4

30、2第42页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四初始污染菌检测采样方法 供试液制备供试品是敷料、可以破坏性类可用无菌手续称取10g,放入100ml灭菌生理盐水中充分振荡后取样。作为1：10的供试液。2.供试品是液体取10ml加至100ml灭菌生理盐水中充分振荡后取样。作为1：10的供试液。3.对供试品不能采用破坏性取样可用浸有无菌生理盐水拭子涂抹采样，被采表面积为100cm2.加入灭菌生理盐水100ml。作为1：10的供试液。4.可用破坏性方法取样供试品：（参照中华人民共和国药典2005年规定进行)5、采样数量：各类产品每批随机抽取10件样品。6、检验方法：将每样取5份平行样，

31、参照GB7918.2规定进行。 2008年5月43第43页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四初始污染菌检测7、结果计算公式： 平均菌落数稀释倍数菌数 菌数/每件次（或g） = 件次或重量（g）注意事项： 供试品的取样必须在万级环境中100级净化条件下，无菌操作，防止污染。应严格遵守无菌操作，同时消除抑菌成份的干扰。2008年5月44第44页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四初始污染菌检测供试液制备推荐的制备方法样 品 制 备供试液制备梯度稀释加 样用灭菌剪刀将纱布剪成小块，称取10g，移入100ml稀释剂中，保温于45水浴中510min，不时振摇。作为1

32、：10供试液。供试液10倍递减稀释。尽量避免丝线等杂物的混入。（1）每个稀释级各吸取1ml至每个灭 菌平皿，每个稀释级注2个平皿。（2）经灭菌完毕的营养琼脂培养基冷却至45-50 时，倾注上述各个平皿15ml，另倾注一个不加样品灭菌空平皿作空白对照。以顺时针或逆时针方向快速转动平皿，使供试液与培养基充分混匀。纱布模拟2008年5月45第45页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四初始污染菌检测梯度稀释1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml供试液9mlNacl9mlNacl1:101:1001:10002008年5月46第46页，共78页，2022年，5月20日，12点

33、2分，星期四平皿号细菌数平行行间1：101:100空白对照3748h菌落计数3748h菌落计数 1212菌落均值2008年5月47第47页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四初始污染菌检测培 养将已经凝固的平板倒置于37培养箱中，一般培养482h。菌落计数计数方法：将平板置菌落计数器或从平板的背面直接以肉眼用标记笔点计，以投射光衬以暗色背景，仔细观察，计数。必要时可以借助于放大镜、菌落计数器。菌落特征： 形态特征：常为白色、灰白色或灰色，亦有淡褐色、淡 黄色（如果培养基中加入0.1%TTC试剂，菌落为红色） 边缘整齐或不整齐，表面有光滑、粗糙，皱褶、突起或 扁平。 大小差异很

34、大。2008年5月48第48页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四初始污染菌检测菌落计数菌落计数基本规则1、选取平均菌落数在30300之间的稀释级作为报告菌落数测定范围。 如只有1个稀释级平均菌落数在30300之间，则将稀释级的菌落数乘以稀 释倍数报告。2、如有两个相邻稀释级的平均菌落数在30300之间，则先计算两稀释级菌落数的比值。 高稀释级的平均平板菌落数稀释倍数比值= 低稀释级的平均平板菌落数稀释倍数当比值2时，则以2个稀释级的平均菌落数均值报告。当比值2时，则以低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数报告。3、如各稀释级平均菌落数均在300以上，则按最高平均菌落数乘以稀释倍数

35、报告；如各稀释级平均菌落数均在30以下，则按最低平均菌落数乘以稀释倍数报告。2008年5月49第49页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四初始污染菌检测菌落计数菌落计数基本规则4、如各稀释级平均菌落数均不在30300之间，则以最 接近30或300的稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告。5、如各稀释级平均菌落数均无菌落生长或最低稀释级平 均菌落数小于1时，应报告菌数为10个/g或ml。6、如有3个稀释级平均菌落数均在30300之间，则以后2级计算级间比值报告。7、菌落计数的报告，菌落数在10以内时，按实有数值报告。大于100时，采用二位有效数字，在两位有效数值后面，应以四舍五入法计

36、算。在报告菌落数为“不可计”时，应表明样品的稀释度。2008年5月50第50页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四初始污染菌检测菌落计数细菌计数结果及报告方法例次不同稀释度的平均菌落数两稀释度菌数之比菌落总数个/g或个/ml报告方式个/g或个/ml10-110-210-311365164201640016000或1.610422760295461.63800038000或3.810432890271602.22710027000或2.71044不可计4650513513000510000或5.1105527115270270或2.71026不可计305123050031000

37、或3.11042008年5月51第51页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四控制菌的检查:参照药典2005版、GB15979-2002 1.大肠埃希菌 BL增菌培养MUG培养靛基质试验 具体检查见表1： 结果判断 MUG阳性、靛基质阴性，或MUG阴性、靛基质阳性，则应取胆盐乳糖培养基的培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养1824小时。若平板上无菌落生长、或生长的菌落与表3所列的菌落形态特征不符，判供试品未检出大肠杆菌。若有可疑菌落，进行IMVic。2008年5月52第52页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四表3大肠埃希菌菌落

38、形态特征培养基 菌落形态曙红亚甲蓝琼呈紫黑色,浅黑色,蓝紫色或粉色,菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心,圆形,稍凸起,边缘整齐,表面光滑,湿润,常有金属光泽.麦康凯琼脂鲜桃红色或微红色,菌落中心呈深桃红色,圆形,扁平,边缘整齐,表面光滑.2008年5月53第53页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四表1 大肠杆菌的检查试验组培养基 加入培养时间h5mlMUG培养基5h、24h366nm紫外灯观察24h后加入靛基质供试品阳性对照胆盐乳糖培养基100ml10ml供试液+ 50100cfu大肠24-480.2ml有荧光玫瑰红供试品10ml供试液0.2ml无荧光试剂本色阴性对照10ml

39、稀释剂0.2ml无荧光试剂本色2008年5月54第54页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四表2结果判断MUG-I麦康凯培养基IMVic结果+ +检出大肠杆菌- -未检出+ -无菌生长未检出- +无菌生长未检出+ -有菌生长-+- -检出大肠杆菌- +有菌生长+-检出大肠杆菌2008年5月55第55页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四2.金黄色葡萄球菌 营养肉汤增菌培养平板（高盐）划线培养观察血浆凝固酶试验 具体检查方法见表3：2008年5月56第56页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四表3 金黄色葡萄球菌的检查试验组培养基 加入培养时

40、间h再培养 结果供试品阳性对照营养肉汤100ml10ml供试液+ 50100cfu金葡1824小时，必要时可延至48小时划线接种于卵黄氯化钠琼脂培养基或甘露醇氯化钠琼脂培养基的平板上，培养2472小时。典型菌落生长供试品10ml供试液?阴性对照10ml稀释剂无菌落生长2008年5月57第57页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四表4 金黄色葡萄球菌菌落形态特征 培养基 菌落形态卵黄氯化钠琼脂金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围有卵磷脂分解的乳浊圈，菌落直径12mm。甘露醇氯化钠琼脂金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围有黄色环，菌落直径0.71mm。 平板上无菌落生长或生长的菌落不同于

41、表4所列特征，判供试品未检出金黄色葡萄球菌。 平板上生长的菌落与表4所列的菌落特征相符或疑似，应挑选23个菌落，分别接种于营养琼脂培养基斜面上，培养1824 小时。取营养琼脂培养基的培养物进行革兰染色，并接种于营养肉汤培养基中，培养1824小时，作血浆凝固酶试验。2008年5月58第58页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四表5金黄色葡萄球菌鉴定鉴定方法 结果革兰氏染色 G+球菌，呈葡萄状排列无芽孢、无荚膜血浆凝固酶试验(玻片法)阳性对照管血浆凝固应为阳性可疑菌株培养液若血浆凝固者则检出金葡菌阴性对照管血浆应流动自如2008年5月59第59页，共78页，2022年，5月20日

42、，12点2分，星期四3.铜绿假单胞菌增菌培养平板划线培养观察 具体检查方法见表8：2008年5月60第60页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四表5 铜绿假单胞菌的检查（一）试验组培养基加入培养时间h培养基结果供试品阳性对照胆盐乳糖培养基100ml10ml供试液+ 50100cfu绿脓18 24h，必要时延长至48h划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基的平板上，培养1824小时典型菌落供试品10ml供试液?阴性对照10ml稀释剂无菌落生长2008年5月61第61页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四 菌落特点: 铜绿假单胞菌典型菌落呈扁平、无定形、周边扩散

43、、表面湿润，灰白色，周围时有蓝绿色素扩散。 如供试品平板上无菌落生长或生长的菌落与上述菌落特征不符，判供试品未检出铜绿假单胞菌。 如平板生长的菌落特征与上述菌落特征相符或疑似，应挑选23个菌落，分别接种 于营养琼脂培养基斜面上，培养1824小时。取斜面培养物进行革兰染色，镜检及氧化酶试验。2008年5月62第62页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四4.沙门菌试验组培养基加入培养时间h结果供试品阳性对照营养肉汤100ml10ml供试液+ 50100cfu沙门菌18 24h，必要时延长至48h下面试验?供试品10ml供试液阴性对照10ml稀释剂无菌落生长表6 沙门菌的检查（一）

44、2008年5月63第63页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四菌的名称试验名称 培养基 培养时间h结果 沙门菌 1mL试液加入四硫酸钠亮绿培养基10mL中划线接种胆盐乳酸琼脂和麦康凯琼脂 1824 1824无菌或特征不符，判断未检出有菌生长或可疑菌做 三铁糖23菌落接种三铁糖琼脂培养基、穿刺高层接种 1824斜面未见红色、底层未见黄色；或斜面黄色、底层无黑色。判未检出。否则取三铁糖斜面培养物继续做下面试验及血清凝集试验。靛基质试验 蛋白胨水培养基 24靛基质数滴 阳性：液面玫瑰红色阴性：试剂本色表7 沙门菌的检查（二）2008年5月64第64页，共78页，2022年，5月20

45、日，12点2分，星期四沙门菌脲酶试验 尿素培养基 24 阳性：斜面变红色阴性：不变色 氰化钾试验各一环氰化钾培养基和对照培养基 2448 对照管有菌生长，试验管有菌生长是阳性赖氨酸脱羧酶试验 赖氨酸脱羧酶培养基和对照培养基 2448对照管应为黄色，试验管紫色为阳性，黄色为阴性 动力检查 穿刺半固体培养基 24细菌沿穿刺外周扩散生长为动力阳性。阳性培养物在室温保存23d再观察 2008年5月65第65页，共78页，2022年，5月20日，12点2分，星期四表9沙门菌菌落形态特征培养基菌落形态胆盐硫乳琼脂无色至浅橙色，半透明，菌落中心带黑色或全部黑色或无黑色。沙门、志贺菌属琼脂无色至淡红色，半透明或不透明，菌落中心有时带黑褐色。曙红亚甲蓝琼脂无色至浅橙色，透明或半透明，光滑湿润的圆形菌落。麦康凯琼脂无色至浅橙色，透明或半透明，菌