中药免疫调节剂对小鼠细胞免疫功能的影响

1、中药免疫调节剂对小鼠细胞免疫功能的影响刘翠艳,赵宏坤，韩春杨【关键词】中药免疫调节剂;,小鼠;,脾淋巴细胞转化;,含药血清摘要目的:讨论中药免疫调节剂对正常小鼠及环磷酰胺(y)所致免疫抑制小鼠细胞免疫功能的影响。方法:以y诱导建立免疫抑制小鼠模型,给正常小鼠和免疫抑制小鼠饮服中药及生理盐水,采用TT法检测淋巴细胞的增殖反响情况。结果:试验各组小鼠脾细胞在48h培养时间内淋巴细胞转化率与各组含药血清参加到正常小鼠脾细胞反响体系中,在一样培养时间内的淋巴细胞转化率呈高度正相关。表现为:在机体正常条件下,两个中药组与正常组之间差异无统计学意义P0.05,但均高于y组P0.05;在免疫抑制条件下,两个

2、中药组明显高于正常对照组和y组P0.05,且中药免疫调节剂组优于玉屏风组P0.05;另外,50L/L浓度的含药血清优于100L/L浓度的含药血清P0.05。结论:该中药免疫调节剂能显著促进免疫抑制小鼠淋巴细胞的转化,而对正常小鼠作用不明显。关键词中药免疫调节剂;小鼠;脾淋巴细胞转化;含药血清目前,国内外在中药免疫调节剂的研究开发方面,研究单味药和其所含的单体成分最多的是多糖,其次为有机酸、甙类、生物碱、黄酮等占多数1-3,复方研究较少且不深化。但是,正是复方制剂的复杂成分才获得了单味药和单体成分所不具备的药效整体性和协同互补作用,使疗效增强、毒副作用减少,在实际应用中更具优势。为此,我们根据中

3、药方剂的组成原那么,结合现代药理学研究成果,以具有免疫调节作用的经典方剂“玉屏风散为对照,通过体外筛癣毒性测定,最后由黄芪、茯苓、白术、甘草、防风、桔梗6味药组成了复方中药免疫调节剂,并用TT法讨论了该中药免疫调节剂对正常小鼠及y所致免疫抑制小鼠细胞免疫功能的影响。1材料和方法1.1材料RPI1640培养基Gib公司;TT四甲基偶氮唑盐,Ares公司,以pH7.2的RPI1640培养液制成5g/L溶液;PHASiga公司,以pH7.2的RPI1640培养液制成200g/L溶液;小牛血清(杭州四季青生物工程,批号:051215);环磷酰胺y,上海华联制药,批号:050306;中药免疫调节剂ZY:

4、黄芪、茯苓、白术、防风、甘草、桔梗组成复方免疫调节剂,采用自动循环煎药机提取浓缩,按照生药量计算使终浓度为300g/L,购自山东泰安工商联医药商行。玉屏风散YPF:选自?中国兽药典?;0175型2恒温培养箱日本SANY;I3168型倒置相差显微镜重庆光学仪器厂;2022型BLELLHT系列酶标仪郑州博塞生物工程有限责任公司;SJIF型超净工作台苏净集团苏州安泰空气技术;96孔细胞培养板BetnDikinsn,USA;6周龄昆明种小鼠72只,质量1820g,雌雄各半,购自山东米歇尔生物制品动物饲养中心,实验动物消费答应证号:20220011。1.2方法1.2.1动物分组及处理方法将72只小鼠随机

5、分为6组:第1组为正常对照组,定量给水给料;第2组为y对照组,于试验的第4天注射y,按50g/kg,连续7d;第3、4组为中药免疫调节剂组简称中药组,小鼠给药方式采取饮水给药,1次/d,按体外表积折算动物的等效剂量的2倍给药,12L/(d鼠),连续15d;第5、6组为玉屏风散组,12L/(d鼠)。其中第3、5组只给药不注射y,第4、6组给药并于第4天饮完药1h后注射y剂量、疗程同第2组。1.2.2含药血清的制备采用摘眼球法在最后一次给药1h后采血前先禁食12h采血。血液置于1L离心管内,静置2h,3000r/in离心20in,无菌别离血清,56水浴30in灭活后,置4冰箱保存,24h内使用。1

6、.2.3小鼠脾淋巴细胞的制备各组小鼠无菌取脾脏,在冷Hanks液中将脾组织制备成单个脾细胞悬液,1500r/in离心10in,弃上清液,参加6L8.3L/LTrisNH4l,37水浴5in使红细胞裂解后1500r/in离心10in,弃上清液,参加适量Hanks缓冲液吹洗3次,每次1500r/in离心10in,弃上清液,用不含血清的RPI1640培养液调整细胞密度至5109/L,并用台盼蓝染色检测细胞活力95%。1.2.4脾淋巴细胞增殖反响的测定1.2.4.1含药血清对正常小鼠脾淋巴细胞转化的影响当血清浓度为50L/L时,在96孔细胞培养板上,每孔参加50L5109/L小鼠脾淋巴细胞,45L不含

7、血清的RPI1640及5L含药血清;当血清浓度为100L/L时,在96孔细胞培养板上,参加50L5109/L小鼠脾淋巴细胞,40L不含血清的RPI1640液及10L含药血清。每组血清设4个重复孔,并与同等浓度的小牛血清RPI1640液作比拟,同时设培养液空白对照。1.2.4.2各试验组小鼠脾细胞的淋巴细胞转化试验在96孔细胞培养板上,每孔参加用含100L/L小牛血清RPI1640稀释的5109/L小鼠脾淋巴细胞95L,A、B、D4横排各孔均参加不含血清的RPI1640液5L,E、F、G、H4横排各孔均参加200g/L的PHA5L,每组细胞设4个重复孔,并用含100L/L小牛血清的RPI1640

8、作空白对照。上述细胞均置37、50L/L2及饱和湿度下培养44h,各孔加5g/L的TT10L,继续培养4h后,参加SDSDF溶解液50L,30in后用酶标仪测A570,结果用刺激指数SI表示:SI试验孔A均值/对照孔A均值100%。1.2.5数据处理应用统计软件SPSS10.0进展分析,所有数据用均值标准差xs表示。2结果2.1各组小鼠脾淋巴细胞转化结果y对照组小鼠脾淋巴细胞转化的A570值明显低于正常对照组,有统计学差异P005;中药免疫调节剂组和玉屏风散组小鼠脾淋巴细胞转化的A570值与正常对照组差异无统计学意义P0.05;而y+中药免疫调节剂组和y+玉屏风散组小鼠脾淋巴细胞转化的A570

9、值明显高于正常对照组P0.05,且y+中药免疫调节剂组对于淋巴细胞转化的促进作用优于y+玉屏风散组P0.05。另外,在PHA的刺激下,各组淋巴细胞转化的A570值都有了显著进步,且以y+中药免疫调节剂组及y+玉屏风散组最为明显P0.05,表1。表1各组小鼠脾淋巴细胞转化结果略注:同一列数值标有一样字母者之间无统计学意义;标有不同字母者之间有统计学差异(P0.05),下表同.表2含药血清对小鼠脾淋巴细胞转化的影响略2.2含药血清对小鼠脾淋巴细胞转化的影响在安康小鼠脾淋巴细胞的转化试验中,无论参加浓度为50L/L还是100L/L的各试验组血清,y+中药组及y+玉屏风散组A570值明显高于其他组P0

10、.05;y对照组A570值明显低于正常对照组P0.05;单纯的中药组和玉屏风散组A570值与正常对照组差异无统计学意义P0.05,但均高于y组血清P0.05。说明含药血清对免疫功能异常小鼠具有明显的免疫调节功能,且在50L/L血清浓度时y+中药组血清的促进淋巴细胞转化作用优于y+玉屏风散组P0.05。50L/L血清浓度与100L/L血清浓度相比,有统计学差异P0.05,表2。3讨论目前,检测淋巴细胞转化最常用的方法是同位素掺入法和TT法,实验证明两种方法具有显著的相关性4。本试验中选用TT法研究中药免疫调节剂对小鼠细胞免疫功能影响。屡次重复试验结果说明,在对试验各影响因素进展充分优化的根底上,

11、TT法确实简便实用,重复性好。“玉屏风散为扶正固表的经典方剂,近年来大量的体内外研究说明其对免疫系统存在着较为广泛的影响5。玉屏风散含药血清具有明显活化小鼠白细胞和腹腔巨噬细胞作用,对脾淋巴细胞增殖、IL2产生有促进作用,对NK细胞的活性有明显的增强作用6;因此我们的试验选用“玉屏风散为对照方剂。本试验中采用了各组小鼠脾细胞直接做淋巴细胞转化试验以及把各组含药血清加到淋巴细胞转化反响体系中两种不同的研究方法,其结果一致说明:玉屏风散和中药免疫调节剂对正常小鼠脾淋巴细胞转化均未出现明显的促进作用,而对免疫抑制小鼠却效果明显,且以中药免疫调节剂作用更好。血清药理试验还说明,50L/L、100L/L

12、两种含药血清浓度对脾淋巴细胞的增值均有促进作用,经统计学分析,50L/L的血清浓度效果优于100L/L的血清浓度。由此我们可以认为,在机体处于免疫抑制的状态下,中药对免疫系统能更好的发挥其正向调节作用,促进淋巴细胞增殖,增强机体免疫力。有试验说明,鳖血提取物、玉屏风散和四君子汤对免疫功能低下的小鼠的促进作用明显高于正常小鼠7,8。分析其原因,我们认为可能是由于免疫抑制剂环磷酰胺毒副作用较小,在环磷酰胺作用下淋巴细胞未分裂也未凋亡,当应用中药免疫调节剂解除其抑制作用后,中药成分影响了免疫抑制小鼠的神经、内分泌功能,从而改变了神经内分泌免疫调节网络平衡,使得免疫抑制小鼠对药物的反响性高于正常对照组

13、,造成短时间内免疫细胞超常分裂的结果。中药血清药理学研究方法针对中药及其复方成分的复杂性,以及中药汤剂及粗提物的体外试验受到其电解质、浸透压等多种因素的影响,以动物含药血清代替中药煎剂或粗提物进展体外试验,比拟接近于动物体内环境,增加了中药体外试验的真实性、可信性和科学性。但目前该方法还有许多影响因素尚未标准,因此对于任何一个试验都有必要尽可能细致地讨论其每一个影响因素,特别是象给药量、采血时间点、血清添加浓度等因素。试验中我们的采血时间设在给药后1h,是根据时效关系的预试验确定的。在预试验中,对y所致免疫抑制小鼠给药后15、30、60、90、120、180、240in共7个时间点分别采血别离

14、血清,用于淋巴细胞转化率的测定,结果给药后30120in采集的血清与对照组比,均能显著促进小鼠淋巴细胞的转化,以给药后60in采集的血清效果最好,故正式试验时我们的采血时间设在给药后1h。其他几种处理方式的选择根据:小鼠的给药方式不采用传统的灌胃法,而是采用在干渴状态下饮水的方式,不但能减少应激,不会对消化道造成损伤,而且能大大减少人力和给药操作时间。预先探索小鼠的全天饮水量,然后在干渴的状态下给药,小鼠饮完药液一段时间后再适量补充清水。试验说明,这种给药方式是可行的,尤其合适于异味不太大的补养药。y的注射剂量按50g/kg是根据周华等9的试验结果,用50g/kg的剂量不但可以成功造模,还可以

15、充分表达出作用温和的中药复方对免疫抑制动物体液免疫的促进活性。本试验证明,该剂量可以充分表达中药复方对免疫抑制动物的体液免疫功能另文报道和细胞免疫活性的影响。为使细胞生存条件尽可能完全一致,培养过程中也不发生改变,应用不含血清的RPI1640液溶解TT和PHA,可促进细胞对TT和PHA的吸收,增加结晶的产生和减少孵育时间。参考文献:1谢陶吟,赵虎,高向东.多糖单克隆抗体的研究进展J.药学进展,2022,299:391-397.2张群,雷林生,吴曙光.多糖类药物作用的受体及信号转导机制的研究进展J.中草药,2022,36(4):614-616.3张其威,张楚瑜.抗病毒中药研究的最新进展J.中成药,2022,27(1):116-119.4张平,章崇杰,刘杰,等.改进TT法检测自然杀伤细胞的活性J.华西医科大学学报,1996,27(2):213-215.5梁春敏,吴敏毓,夏礼斌.玉屏风散对小鼠白细胞活化作用的血清药理学研究J.皖南医学院学报,2001,20(4):251-253.6梁春敏,王贤喜,董群,