土壤脲酶、蔗糖酶、磷酸酶活性的测定

1、土壤酶活性的测定方法及部分样品配制详细请参考土壤微生物分析方法手册，土壤酶及其研究法土壤样品采集与制备土壤样品取样后混匀，用于土壤酶活性测定的土壤磨细过 2mm 筛后，置于 4 C冰箱内保存备测。1. 土壤酶活性的测定方法脲酶采用靛酚蓝比色法方法原理：本法基于以尿素为基质，酶促水解生成的氨与酚类化合物起反应 生成蓝色的靛酚，颜色深度与氨含量相关，用于尿酶活性的测定。操作步骤：取10g风干土，置于100ml三角瓶中，加2ml甲苯，15min后加 10ml 10%尿素液和20ml pH6.7柠檬酸盐缓冲液。摇匀后在37 C恒温箱中培养3h。 按此操作，进行以水代替基质，及无土壤的基质对照测定，过滤

2、后取0 . 5ml 滤液 于 50ml 比色管中，然后按绘制标准曲线显色方法进行比色测定。氮的标液：精确称取0.4717g硫酸按溶于水并稀释至1000ml，则得1ml含 0.1mg 氮的标准液。绘制标准曲线时，可将此液稀释 10 倍供用。pH6.7 柠檬酸盐缓冲液：用 368g 柠檬酸溶于 600ml 水，另取 295g 氢氧化钾 溶于水，再将二种溶液混合，然后用1M的氢氧化钠调节pH到6.7，定容到2L。苯 酚 溶 液 ： 称 取 苯 酚 （ C6H5OH ） 10g 和 硝 基 铁 氰 化 钠 Na2Fe（CN）5NO2H2O100mg稀释至1L。此试剂不稳定，须贮于棕色瓶中，在4C 冰箱

3、中保存。次氯酸钠碱性溶液： 称 取 氢 氧 化 钠 （ 化 学 纯 ） 10g 、 磷 酸 氢 二 钠 （Na2HPO4 7H2O,化学纯）7.06g、磷酸钠（Na3PO4 12H2O，化学纯）31.8g 和52.5g L-1次氯酸钠（NaOCl，化学纯，即含5%有效氯的漂白粉溶液）10mL 溶于水中，稀释至1L,贮于棕色瓶中，在4C冰箱中保存。标线绘制：取稀释的标准液0、l、2、4、6、8、10ml，移于50rnl容量瓶中， 然后加入蒸馏水至20mL。再加4mL苯酸钠溶液和4mL次氯酸钠溶液，随加随 摇匀。 30min 后显色，定容。在分光光度计上于 578nm 处比色。根据光密度值与 溶液

4、浓度绘制标线。蔗糖酶采用磷钼酸比色法方法原理：本法基于蔗糖酶酶解所得还原糖具有的还原性，能使磷钼酸络合物 生成蓝色化合物，颜色强度与还原糖量相关，因而用比色测定还原糖量用于表示 酶的活性。操作步骤：称5g 土，置于100ml三角瓶中，加入10ml水，1ml甲苯。摇匀 使土壤均有分散后，放置 15 分钟，加入15 毫升5蔗糖-磷酸缓冲液，摇匀混合 物后，放入恒温箱，在37C下培养24h。按此操作，用不加土壤的基质和150 摄氏度干热灭菌 1 小时的土壤进行对照试验，吸取 0.5ml 滤液于 50ml 比色管中， 按标准曲线步骤显色测定，pH5.5磷酸缓冲液：1/15M磷酸氢二钠（11.867g

5、Na2PO42H2O溶于1L蒸馏 水中）0.5ml加1/15M 磷酸二氢钾（9.078KH2PO4溶于1L蒸馏水中）9.5ml即成。钼酸铵溶液：a） 5%钼酸铵溶液；b） 200ml浓硫酸加入800ml水，使用前按 1:1 将 a 与 b 混合5蔗糖溶液（ pH5.5 磷酸缓冲液配制）铜试剂：a） 50gCuSO4 5H2O 溶于 500ml 水；b） 25gNa2CO3。25g 酒石酸钾 钠，20g NaHCO3和200gNa2S04溶于水并稀释到1L，加几滴甲苯防腐，使用前 按 1:25 将 a 与 b 混合。标准糖溶液：将 100 毫克葡萄糖和 100 毫克果糖溶于水，稀释到 200ml

6、（1 毫克还原糖/1 毫升）标准曲线的绘制：取不同体积，由 0.5 至 50ml 标准糖溶液于 100ml 容量瓶 中，加入10ml醋酸缓冲液，用水稀释到刻度，从每瓶中取2.5ml溶于50ml容量 瓶中，加入4ml铜试剂，摇匀，在烘箱内与105摄氏度左右放置25分钟，取出 冷却至室温，依次加入2ml 0.25M磷酸氢二钠和5ml钼酸铵试剂，随加随摇匀， 待二氧化碳逸出后，放置1小时，摇匀，于578nm处比色测定。酸性磷酸酶采用磷酸苯二钠比色法方法原理 本法基于以磷酸苯二钠为基质，酶解释放出的酚，使其与氯代溴 苯醌亚胺试剂反应生色，用比色法测定出游离酚量，用其表示酶的活性操作步骤：称 2.5g

7、风干土置于 100mL 三角瓶中，加 1.25mL 甲苯，轻摇 15min 加入 10mL 0.5%磷酸苯二钠（酸性磷酸酶用醋酸盐缓冲液，中性磷酸酶用柠檬酸 盐缓冲液，碱性磷酸酶用硼酸盐缓冲液），仔细摇匀后放入恒温箱，在37C下培 养2h。后于培养液中加50mL 0.3%硫酸铝溶液并过滤，按此操作，进行以水代 替基质，及无土壤的基质对照测定，吸取 0.5mL 滤液于 50mL 容量瓶中，然后按 绘制标准曲线方法显色。于 660nm 处比色.酚的标准溶液：（1）酚原液：取 1g 重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至 1L 于棕色瓶中。（2）酚工作液一取 10ml 酚原液稀释至 1L， （每毫升含 0.01mg 酚）标准曲线绘制：取 0， l， 2， 4， 6， 8， 10mL 酚工作液，置于 50mL 容量瓶 中，每瓶加入 5ml 缓冲液和 4 滴