第七章抗原抗体反应及应用-暨南大学抗体工程研究中心

1、第七章 抗原抗体反应及应用 不论天然的还是人工合成的分子，只要能被机体的免疫系统识别的都可以诱导机体的免疫应答，产生相应的抗体。大多数抗体和抗原本身是既有免疫原性(诱发产生特异抗体)，又有反应原性(与特异的抗体相结合)。抗原与抗体的特异性反应不仅可以在体内进行，而且可以在体外进行。一切利用血清学技术方法所进行的各种测试都是基于这一根本的特性。抗体反应技术的应用之广泛已经远远超出了免疫学、医学、甚至生命科学的范围，成为类微量，灵敏，快速的检测分析方法。本章着重介绍抗体制备，抗体抗原反应原理及技术方法的应用。第一节抗体体的制备备 环环境中的的大部分分生物(包括病病原生物物)及其其产物分分子和一一些

2、化合合物对哺哺乳动物物的免疫疫系统而而言是外外源抗原原，这些些抗原能能通过侵侵染或其其他的途途径刺激激免疫系系统，产产生以抗抗体为主主的体液液免疫应应答。同同样用抗抗原人工工免疫实实验动物物，可以以获得含含有特异异性抗体体的血清清，称为为抗血清清(anntisseruum)，因因血清中中抗体是是多个抗抗原决定定簇刺激激不同BB细胞克克隆而产产生的抗抗体，所所以称多多克隆抗抗体(ppolyycloonall anntibbodyy)。一一个B细细胞克隆隆所分泌泌的抗体体即为单单克隆抗抗体。用用免疫动动物的BB细胞与与骨髓瘤瘤细胞融融合，在在体外可可以分离离出许多多单个BB细胞克克隆，以以此方法法

3、可制备备单克隆隆抗体(monnocllonaal aantiiboddy)。随随着分子子生物学学技术的的发展，已已经可以以用抗体体基因文文库(aantiiboddy ccombbinaatorriall liibraary)筛选制制备单克克隆抗体体。应用用基因工工程技术术，根据据需要对对抗体进进行改造造，获得得基因工工程抗体体(ennginneerringg anntibbodyy)，以以及催化化性抗体体(caatallytiic aantiiboddy 或或aboozymme)等等的全新新的抗体体。 一、抗抗血清的的制备 1免免疫动物物 (1)抗原：免疫动动物是制制备抗血血清的第第步。免免疫

4、所用用的抗原原可用病病毒、细细菌或者者其他蛋蛋白质抗抗原，如如果使用用半抗原原如小分分子激素素等，必必须与大大分子载载体连接接，连接接剂见表表71。抗抗原的用用量视抗抗原种类类及动物物而异，次注射小鼠可以少至几个微克，免、羊甚至更大的动物每次注射的量就相应增加，从几百g次至几mg次。2)佐剂剂及乳化化：佐剂剂可以帮帮助抗原原在注射射部位缓缓慢释放放，以增增加免疫疫刺激的的效果。佐佐剂有完完全和不不完全佐佐剂之分分。完全全佐剂加加有灭活活的分枝枝杆菌(如卡介介苗)或或棒状杆杆菌。福福氏佐剂剂可从试试剂公司司购买，也也可用羊羊毛脂和和石蜡油油按1：24混合合自行制制备。佐佐剂与抗抗原按11：1的的

5、比例混混合乳化化为均匀匀的乳液液，放置置后不会会发生油油水分离离。 (3)免免疫动物物：常用用于制备备抗血清清的动物物打豚鼠鼠、家免免、小鼠鼠、大鼠鼠等，如如果大量量生产可可用动物物羊、马马等，动动物接受受免疫的的乳液量量小鼠为为100200 mLL，家兔兔为24mLL。抗原原免疫动动物的途途径取决决于动物物种类、抗抗原特性性和是否否使用佐佐剂。腹腹腔注射射(ip)，肌肌肉注射射(im)，皮皮内注射射(id)和皮下下注射(scc)适适合于任任何抗原原，这些些途径主主要刺激激局部淋淋巴结发发生免疫疫应答，初初次免疫疫和免疫疫加强注注射均可可使用。静静脉注射射(i.v.)则只适适合于可可溶性抗抗原

6、及分分散的单单细胞悬悬液，且且不能使使用佐剂剂，其诱诱发的免免疫应答答主要发发生在脾脾脏。此此外，在在单克隆隆抗体制制备时，亦亦可用脾脾脏直接接注射或或体外免免疫方法法，尤其其对微量量抗原比比较实用用。体外外免疫方方法也常常用于人人源单克克隆抗体体的制备备。体外外免疫时时将脾细细胞或外外周血淋淋巴细胞胞(包括括B细胞胞，T细细胞及抗抗原递呈呈细胞)与抗原原一起作作体外培培养，然然后再与与骨髓瘤瘤细胞融融合。初初次免疫疫后要经经过23次以以上的免免疫加强强以保证证能形成成较高水水平的IIgC抗抗体。两两次免疫疫注射之之间的时时间间隔隔，一般般34周比比较适合合大部分分动物，小小动物可可间隔110

7、14dd，大动动物则在在2月左左右。在在免疫加加强最后后一次注注射后的的一周内内采集抗抗血清，可可获得高高水平的的抗体。 22抗血清清的纯化化与保存存 （11）采血血：加强强免疫的的动物223次后后，可通通过耳静静脉或眼眼球(小小鼠)采采血，进进行抗血血清效价价测定。当当效价达达到理想想的高度度后，可可以采血血。采血血方式可可以从心心脏直接接取血，也也可通过过动脉放放血。待待血液凝凝固后用用针筒或或吸管吸吸取血清清。 (2)抗抗血清的的纯化与与保存：除抗体体外血清清中含有有多种其其他蛋白白成分。为为了避免免这些蛋蛋白质干干扰抗体体(免疫疫球蛋白白)标记记反应和和抗原抗抗体反应应，抗血血清可经经

8、过纯化化以获得得单一的的机体(常为IIgG)组分。常常用的纯纯化IggG的方方法为饱饱和硫酸酸胺盐析析和层析析法。蛋蛋白质在在不同的的盐浓度度的溶液液中，其其溶解度度不一样样，盐离离子干扰扰蛋白质质和水分分子间氢氢键形成成，因为为水盐结合合比水蛋白质质结合更更稳定，蛋蛋白质即即可从溶溶液中沉沉淀出来来。蛋白白质分子子越大，沉沉淀时所所需盐离离子浓度度越低。免免疫球蛋蛋白(MMr 11.5105)比血血清中主主要蛋白白质白蛋蛋白(MM r 6.77104)的分分子大得得多，抗抗体在33050饱和度度的硫酸酸盐中析析出，而而白蛋白白需在77080饱和度度才析出出，因此此常用333饱饱和度的的硫酸胺

9、胺纯化血血清中的的IgGG。盐析析时为了了减少抗抗体变性性，需在在4进行，同同时用ppH8.0缓冲冲液稀释释抗血清清，以减减少蛋白白浓度过过高而发发生共沉沉淀。铵铵盐的溶溶解度不不随温度度变化而而明显改改变，00和25仅差33，而而钠盐则则相差55倍，因因此常在在低温沉沉淀时用用铵盐，室室温沉淀淀用钠盐盐。铵盐盐对抗体体的标记记反应(如FIITC和和biootinn标记时时)有一一定的干干扰作用用。 盐盐析法只只能部分分纯化抗抗体，更更高纯度度的抗体体制剂可可用层析析法制备备。 IIgM五五聚体相相对分子子质量达达9.77105，比血血清中任任何其他他蛋白都都大，用用分子筛筛层析很很容易将将其

10、纯化化。IggG在PPH 880时时带负电电荷，能能与DEEAE纤纤维素上上的阳离离子结合合，因此此可用离离子交换换层析来来纯化IIgG。IIgG纯纯化最常常用的方方法为亲亲和层析析。IggG与葡葡萄球菌菌A蛋白白和链球球菌G蛋蛋白具合合高度的的亲和性性，可用用这两种种蛋白质质交联亲亲和层析析柱将IIgG纯纯化。大大部分IIgG与与蛋白AA结合PPH为889，洗洗脱PHH为24；而而与蛋白白G的结结合PHH为57，洗洗脱PHH为910。CC蛋白更更适合于于IgGG的纯化化，不但但反应条条件为温温和的弱弱酸性或或弱碱性性，并且且与IggG的结结合力高高于A蛋蛋白。GG蛋自能能与大部部分动物物种类

11、的的IgGG结合，而而A蛋白白对小鼠鼠IgGG1、大大鼠IggG2bb、人IIgG33、马和和绵羊IIgG结结合力弱弱或不能能结合GG蛋白和和A蛋白白均不能能与鸡IIgG结结合。 抗抗血清或或纯化的的抗体在在低温保保存可维维持活性性数年，反反复冻融融使抗体体很快失失活，被被细菌或或霉菌污污染的抗抗血清或或IgGG制品也也易失去去活性。稀稀释的抗抗血清加加入防腐腐剂叠氮氮化钠和和保护剂剂如BSSA等可可于4保存。长长期保存存常用等等量甘油油于20以下冷冷藏。也也可置于于 500饱和和硫酸铵铵中4保存，还还可以冷冷冻干燥燥保存。 33抗血清清的特性性鉴定 根根据不同同目的制制备的抗抗血清，对对其中

12、所所含抗体体的浓度度，特异异性及免免疫球蛋蛋白种类类的要求求也不一一样。为为了获得得质量和和数量上上合符要要求的抗抗血清，在在收集动动物血清清前必须须对免疫疫效果进进行检测测，对收收获后的的抗血清清也必须须对些参数数进行分分析，如如效价、亲亲和力及及交叉反反应等。 根据据不同的的抗原性性质选用用合适的的检测方方法。最最常用的的为免疫疫沉淀，EELISSA，放放射免疫疫等。 效效价又称称滴度(titter)，是常常用于表表达抗血血清中特特异性抗抗体相对对含量的的个半定定量指标标，即在在给定的的条件下下，结合合定量抗抗原的抗抗血清的的稀释度度。抗血血清经一一系列稀稀释后(如倍比比稀释)与定量量的抗

13、原原反应，以以能检测测抗血清清最大稀稀释倍数数即为该该抗血清清的效价价。不同同的检测测方法测测定同一一种抗血血清的效效价，灵灵敏度不不一样，抗抗血清的的效价也也不一样样，如沉沉淀反应应(琼脂脂双扩散散)与EELISSA二者者的效价价相差甚甚大，后后者远高高于前者者。放射射免疫分分析(RRIA)常用于于标记小小分子抗抗原来检检测抗血血清的效效价。 亲亲和力(afffiniity)表示抗抗血清与与相应抗抗原的结结合强度度，是描描述抗体体持异性性的重要要指标，常用亲和常常数K表表示。亲亲和常数数K与抗抗原抗体体反应的的平衡常常数有关关： K+ AgAbb AggAb KAgAbb K+ K= KK=

14、AgAb KK 式中K+为为结合速速度常数数，K为解离离速度常常数。亲亲和常数数K的测测定见第第二节 抗抗体特异异性与交交叉反应应：抗体体是特异异的。只只与相应应抗原反反应。实实际制备备的抗体体却常有有非特异异性反应应，这是是因为抗抗原不纯纯造成的的。多组组分抗原原之间存存在共同同的抗原原决定簇簇，或者者两个抗抗原决定定簇结构构类似能能与同一一抗体结结合，均均可出现现抗体与与异源抗抗原的交交叉反应应。用琼琼脂双扩扩散能简简便直观观地反映映不同抗抗原与同同一抗血血清，或或不同抗抗血清与与同一抗抗原的交交叉反应应。 二二、单克克隆抗体体的制备备 11制备原原理 单单克隆抗抗体(MMAb)与抗血血清

15、(又又称多克克隆抗体体，PAAb)最最主要的的区别是是MAbb为单一一种B细细胞克隆隆所产生生的一种种均一的的免疫球球蛋白分分子。所所以MAAb是BB细胞克克隆的标标志，是是一种独独特型的的抗体，它它的特异异性是针针对一个个抗原决决定簇的的。制备备单克隆隆抗体不不能用化化学分离离的方法法从多克克隆抗体体中去分分离纯化化得到它它，而是是用分离离产生抗抗体的BB细胞克克隆的方方法得到到它。为为了使BB细胞克克隆能在在体外人人工培养养下长期期存活并并产生完完全均一一的MAAb，GGKhleer合MMilssteiin于119755年创立立了杂交交瘤方法法。所以以制备单单克隆抗抗体的技技术又称称杂交瘤

16、瘤技术(hybbreddomaa teechnniquue)。 杂杂交瘤技技术的基基本原理理是用分分泌抗体体但不能能长期培培养的BB细胞与与能在体体外长期期培养并并可低温温保存的的肿瘤细细胞进行行杂交。筛筛选得到到的杂交交瘤细胞胞应该是是既能分分泌抗体体又有瘤瘤细胞的的特性，可可长期传传代培养养，又可可在液氮氮中保存存的细胞胞。把这这些细胞胞单克隆隆化，用用单克隆隆化的杂杂交瘤细细胞进行行单克隆隆抗体的的生产（图图711）。 2BB细胞与与瘤细胞胞的来源源及杂交交瘤选择择原理 最最常用的的单克隆隆抗体是是小鼠的的单抗，此此外也有有大鼠的的和人源源的单抗抗。人源源单抗制制备比较较复杂。小小鼠单抗

17、抗的制备备通常是是使用BBalbbc小小鼠的BB细胞和和它的骨骨髓瘤细细胞。大大鼠的单单抗制备备通常用用Louuc大大鼠及其其骨髓瘤瘤和Y33AOO大鼠及及其骨髓髓瘤细胞胞(表772)。BB细胞是是从免疫疫动物的的脾脏中中分离出出来的。动动物免疫疫方法与与抗血清清制备相相同，只只是在制制备脾脏脏前3dd必须进进行一次次静脉加加强注射射以保证证得到的的B细胞胞有旺盛盛的分泌泌抗体的的活性。骨骨髓瘤细细胞有许许多细胞胞株是经经过诱变变和筛选选得到的的缺陷型型。筛选选的标准准是瘤细胞胞本身不不产生抗抗体或者者产生抗抗体的某某种链，但但不能分分泌；是次黄黄嘌呤鸟鸟嘌呤核核苷酸转转移酶(HGPPRT)和

18、胸腺腺嘧啶激激酶(TTK)的的缺陷型型。因为为这种缺缺陷型的的瘤细胞胞正常的的核酸合合成途径径被氨基基喋吟(amiinoppterrin)阻断后后，由于于缺失这这些酶，即即使补充充它的底底物次黄黄嘌呤(H)和和胸腺嘧嘧啶(TT)，核核酸合成成的旁路路也不能能起到救救援的作作用，结结果导致致瘤细胞胞死亡(图72)。而而杂交瘤瘤细胞因因带有BB细胞的的全套基基因，在在HATT存在的的条件下下借助于于HGPPRT和和TK的的作用通通过替代代的核酸酸合成途途径能正正常合成成DNAA和RNNA。所所以杂交交瘤能正正常地生生长繁殖殖而被选选择出来来。未被被融合的的游离的的B细胞胞只能存存活3dd而后自自行

19、死亡亡。这就就是用HHAT培培养基进进行选择择的原理理。 3细胞杂杂交与选选择培养养 (1)融融合：细细胞杂交交之前，要要分别准准备好脾脾脏的BB细胞悬悬液和小小鼠骨髓髓瘤细胞胞(如SSP20Agll4细胞胞株)。免免疫后的的小鼠脾脾脏在无无菌条件件下破碎碎，将BB细胞悬悬浮在没没有血清清的培养养液中(通常使使用RPPMIll6400商品配配制)，并并洗涤33次去掉掉小鼠的的血清。SSP20细胞胞是用加加有100胎牛牛或小牛牛血清培培养的，每每天更换换新鲜培培养液使使成为对对数分裂裂期生长长旺盛的的细胞。细细胞用RRPMIIl6440洗涤涤23次，把把两种细细胞合并并在同试管中中，用550的的

20、聚乙二二醇(相相对分子子质量为为1000015000)作作为融合合剂，在在37条件下下融合ll2miin。然然后用116400培养液液缓慢稀稀释，然然后除去去PEGG，将细细胞分散散至HAAT选择择培养板板中。电电融合方方法也可可用于单单克隆抗抗体制备备，虽融融合率较较高，但但一次融融合的细细胞数少少，且需需专门设设备，故故限制了了其广泛泛使用。融融合时脾脾细胞和和骨髓瘤瘤细胞的的比例在在5：1110：1均可可获得满满意结果果，每次次融合细细胞数量量在1007108较为合合适。融融合后的的细胞在在40或或96孔孔板上的的HATT培养液液(RPPMIll6400含10020胎牛或或小牛血血清和H

21、HAT)中377，5CO22条件下下培养。融融合后的的细胞悬悬液中只只有脾细细胞和骨骨髓瘤细细胞形成成的杂交交瘤细胞胞能在HHAT培培养基中中生长，其其他形式式的融合合细胞均均不能生生长未未融合的的细胞也也不能在在HATT培养液液中生存存(表773)。 在在融合后后的细胞胞培养过过程中，饲饲养细胞胞(feeedeer ccelll)有助助于杂交交瘤细胞胞的生长长。饲养养细胞可可用同种种动物的的腹腔细细胞或胸胸腹细胞胞。腹腔腔细胞中中的吞噬噬细胞能能清除死死亡细胞胞碎片。使使背景更更为清洁洁“干净”。同时时饲养细细胞分泌泌的细胞胞因子或或活性物物质有助助于杂交交瘤细胞胞的生长长。现有有商品“杂交

22、瘤瘤细胞生生长因子子”可用于于替代饲饲养细胞胞。 (2)阳阳性杂交交瘤细胞胞的筛选选与单克克降化：杂交细细胞经约约1014dd培养后后，形成成可用的的细胞集集落(克克隆)。经经过几次次更换培培养液(HT培培养液)后进行行抗体活活性检测测。常用用的筛选选枪测方方法是EELISSA和凝凝集试验验，前者者常用于于可溶性性抗原，后后者适用用于细胞胞、细菌菌等表面面抗原。此此外，DDotELIISA、免免疫印迹迹及免疫疫荧光试试验均可可用于杂杂交瘤细细胞的筛筛选。 使许许多细胞胞克隆混混合生长长的细胞胞分离为为单个的的细胞克克隆的过过程称克克隆化(colloniizattionn)最常常用的单单克隆化化

23、方法是是有限稀稀释法(limmiteed ddiluutioon)，即即将混合合细胞经经稀释后后分装于于培养板板上，使培养养板的大大部分孔孔中只出出现一个个细胞。为为了确保保抗体分分泌细胞胞来源于于单个细细胞，克克隆化过过程可重重复进行行，称为为亚克隆隆化(ssubcclonnizaatioon)。除除有限稀稀释法外外，荧光光激活细细胞分拣拣法(FACSS)也用用于杂交交瘤细胞胞的克隆隆化过程程。 44单克克隆抗体体的扩大大生产 产产生特异异性抗体体的单克克隆杂交交瘤细胞胞株应立立即扩大大培养，以以获得足足够的细细胞用于于保存和和生产可可供应用用的抗体体。生产产大量单单克隆抗抗体的方方法目前前

24、常用的的有3种种：小鼠鼠腹水制制备，大大瓶培养养和中空空纤维反反应器，前前者多用用于实验验室制备备，后二二者适应应于工厂厂化生产产。 腹腹水制备备：杂交交骨髓瘤瘤细胞在在腹腔中中定植，并并产生大大量腹水水。选用用与单克克隆抗体体制备所所用相同同的动物物品系或或者含有有相同基基因的FFl代杂杂交品系系。杂交交F1代代品系更更适合于于腹水制制备，如如果用异异源动物物制备腹腹水时可可选用无无MHCC限制性性的裸鼠鼠。用小小鼠制备备腹水时时，先用用矿物油油或Prristtanee致敏，以以抑制其其免疫功功能，利利于腹水水的形成成。腹腔腔注射1106107个杂交交瘤细胞胞，经过过710 d后形形成腹水水

25、。每只只小鼠可可获得335mLL腹水，每每mL含含IgGG抗体可可达510mmg。腹腹水中含含有较多多的杂蛋蛋白和非非特异性性IgGG，并且且含有许许多蛋白白酶，易易使抗体体失活，因因此腹水水收集后后应尽快快纯化，以以防止降降解。 大大瓶培养养：采用用10000mLL或更大大的摇瓶瓶培养。大大瓶培养养上清体体积大，但但抗体浓浓度低，给给抗体纯纯化带来来很大困困难，消消耗人力力和培养养液，增增加生产产成本。 中中空纤维维反应器器：是比比较经济济的单克克隆抗体体生产方方法。该该装置由由具有半半透膜性性质的成成束的微微孔纤维维组成，杂杂交瘤细细胞位于于纤维外外部的小小量培养养液中，培培养液在在纤维的

26、的微孔中中循环，供供给营养养和带走走废物，抗抗体大分分子和小小分子化化合物被被隔开。高高密度的的杂交瘤瘤细胞能能在此系系统中维维持数月月，每天天可产生生数百毫毫克的抗抗体，抗抗体浓度度高，体体积小易易于纯化化。 胎(小)牛血清清一直是是细胞培培养所必必须的，在在单克隆隆抗体生生产过程程中培养养液中的的血清蛋蛋白使抗抗体的纯纯化增加加了困难难，近年年开发的的无血清清培养技技术已逐逐渐用于于单克隆隆抗体的的生产中中。 55人单单克隆抗抗体的制制备 小小鼠的单单克隆抗抗体蛋白白应用于于人体后后，作为为抗原能能引起人人的免疫疫应答，大大大降低低其生物物活性，并并可能导导致变态态反应。因因此人源源单克隆

27、隆抗体在在临床治治疗上有有广泛应应用前景景，引起起人们的的普遍兴兴趣。但但是人单单克隆抗抗体制备备存在许许多技术术上和伦伦理上的的障碍，如如人杂交交瘤细胞胞系不稳稳定，有有些抗原原不能对对人进行行人工免免疫，人人B细胞胞只能从从外周血血中分离离而无法法从脾脏脏取得等等。尽管管如此，一一些人源源单克隆隆抗体已已经获得得，技术术上也在在逐步完完善起来来。 人人的瘤细细胞株UU2666常用来来与人外外周血BB细胞融融合以获获得人源源单克隆隆抗体。另另一些淋淋巴母细细胞抹(LCLL)则来来源于EEB病毒毒转化的的淋巴细细胞，如如GMll5000，W11L2和和ARHH77等等也用于于杂交瘤瘤细胞的的制

28、备。这这些细胞胞系表现现ED病病毒核抗抗原(EEBNAA)阳性性，且形形成的杂杂交瘤细细胞抗体体的分泌泌水平不不高。 获获得人单单克隆抗抗体的另另一方法法是用EEBV直直接转化化某些抗抗体分泌泌细胞，使使之成为为“不死”的细胞胞在体外外培养。EEBV感感染人BB细胞后后，病毒毒基因插插入人BB细胞基基因组中中，有11的细细胞转化化为“不死”的细胞胞。B细细胞转化化可通过过“病毒驱驱动”和“细胞驱驱动”两种方方法获得得。前者者是将BB细胞与与分泌EEBV的的B9558细胞胞系一同同培养，后后者则是是与EBBNA阳阳性的LLCL细细胞一同同培养。“细胞驱动”转化的B细胞比较稳定，抗体分泌能力也较强

29、。 人人淋巴母母细胞系系和人杂杂交瘤细细胞较难难获得，人人单克隆隆抗体也也可以通通过异源源杂文的的办法制制备，即即将EBBV转化化的B细细胞与小小鼠骨髓髓瘤细胞胞融合，将将获得的的异源杂杂交瘤细细胞再与与免疫后后的B细细胞融合合，得到到人单克克隆抗体体分泌细细胞，不不产生自自身免疫疫球蛋白白，EBBVA也也是阴性性。 三三、基因因工程抗抗体的制制备 11抗体体的化学学修饰 抗抗体Fcc段用双双功能连连接剂与与荧光素素，同位位素，酶酶，发光光化合物物，稀土土元素以以及药物物，毒素素等连接接后，并并不影响响其Faab功能能区与特特异性抗抗原结合合。根据据交联物物的性质质不同，标标记的抗抗体可用用作

30、诊断断试剂，也也可作为为药物的的定向载载体，引引导药物物或毒素素到达抗抗原存在在部位使使药物或或使毒素素发挥更更有效的的作用，即即俗称“生物导导弹”。从而而减少药药物、毒毒素、同同位素、酶酶在肿瘤瘤治疗过过程中引引起严重重的副作作用，大大大提高高治疗肿肿瘤的效效果。 许许多毒素素如蓖麻麻毒素，白白喉毒素素，天花花粉，红红豆毒素素等均为为蛋白质质或糖蛋蛋白，可可用双功功能剂与与抗体相相连；吗吗啡，前前列腺素素，氨甲甲喋吟，磷磷酸酯酶酶C等含含有羧基基能用碳碳二亚胺胺(EDDC)，混混合酸酐酐法与抗抗体的氨氨基形成成酰胺键键；同样样，含脂脂肪胺的的药物如如庆大雷雷素，阿阿霉素在在水溶性性EDCC的

31、作用用下与抗抗体的羧羧基连接接；而含含芳香胺胺的药物物则先在在低温下下与亚硝硝酸作用用形成重重氮化合合物，再再与抗体体分子上上的酪氨氨酸或组组氨酸残残基形成成偶氮键键。总之之通过抗抗体的化化学修饰饰把抗体体的特异异性用到到定向给给药和定定位检测测上。 22抗体体基因文文库 抗抗体基因因文库(anttiboody reccombbinaatioon llibrraryy)是将将不同的的重链和和轻链基基因随机机组合，克克隆到合合适的表表达载体体中，在在原核细细胞表达达不同的的抗体，形形成一个个抗体库库，从这这个抗体体库中，用用抗原可可以筛选选到相应应的抗体体基因(图73)。抗抗体基因因来源于于杂交

32、瘤瘤细胞或或动物BB细胞(免疫或或未免疫疫)的DDNA和和mRNNA 。用质粒作为为抗体文文库的载载体，虽虽然也可可能表达达有活性性的抗体体分子或或片段，但但由线状状噬菌体体表达更更为方便便有效。MM13、ffd、FF1等噬噬菌体的的外壳蛋蛋白由55种蛋白白组成：p、p、p、p和p。每种种含量不不一，其其中p含量最最多，每每个噬菌菌体有227000个p亚基，其其余4种种蛋白仅仅5个拷拷贝。增增加噬菌菌体外壳壳蛋白的的长度并并不影响响噬菌体体的装配配，抗体体以融合合蛋白的的形式表表达于噬噬菌体表表面。噬噬菌体表表达质粒粒常用的的有fddCAAT1、ffdttetDOGG1、PPHENN1、ppC

33、ommb3和和pCoomb33H等。抗抗体融合合蛋白构构建多用用p和p，p拷贝数数高，低低亲和力力的抗体体蛋白容容易筛选选出来。在噬菌体表表达抗体体时，常常常不表表达完整整的抗体体分子，（因因为CHH2上不不能进行行糖基化化）。根根据不同同的引物物得到重重链的VVH或VHCH1区，轻轻链的VVL或VLCL区。VVL和VH两个片片段用一一短肽作作连接片片段，形形成单链链可变区区（siingllecchaiin ffraggmennt vvariiablle，sscFvv）；VVHCH1和VVLCL两片段段则形成成Fabb片段。另另外，单单独的VVH和VL也能结结合抗原原，如果果二者形形成同源源或

34、异源源二聚体(ddAb)，则稳稳定性和和亲和性性明显提提高(图图74)。此此外在抗抗体片段段DNAA末端加加上一些些功能蛋蛋白(如如碱性磷磷酸酶和和蛋白毒毒素)的的基因，则则表达的的抗体就就带有一一定生物物活性功功能片段段，可用用于检测测或治疗疗。如果果在抗体体基因末末端加上上终止子子(TAAG)则则表达的的抗体片片段是可可溶性的的，而不不是结合合在噬菌菌体表面面。 用特异异性抗原原免疫的的动物BB细胞构构建抗体体的噬菌菌体文库库，抗体体亲和性性高，用用与免疫疫抗原不不同的抗抗原筛选选得到的的抗体亲亲和性普普遍较低低。可用用模拟天天然体细细胞突变变的方法法来提高高亲和力力。如混混杂重组组法，即

35、即将己获获得的轻轻链或重重链的VV片段切切下，再再克隆至至随机的的文库中中的V区区构成二二级文库库，使HH链和LL链混杂杂，可以以使抗体体片段的的亲和性性提高。利利用PCCR错配配将随机机突变引引人至抗抗体的抗抗原结合合区，也也能提高高对抗原原的亲和和力。先先用低亲亲和力的的载体在在噬菌体体的P表达，筛筛选后、将将抗体基基因片段段PCRR扩增转转至P上表达达，可获获得高亲亲和力的的抗体片片段。 抗抗体基因因文库有有两个优优点，一一是从不不适合进进行人工工免疫的的物种获获得单克克隆抗体体，如人人源单克克隆抗体体；二是是可快速速方便获获得单克克隆抗体体。 33抗体体基因的的改造 将将鼠源抗抗体的V

36、V区基因因与人源源抗体CC区基因因重组，获获得的嵌嵌合抗体体(chhimeericcal anttiboody)，可保保留鼠抗抗体对抗抗原的高高亲和性性，又减减弱鼠源源抗体对对人的免免疫原性性，提高高治疗性性抗体的的效果。重组的嵌合合抗体基基因转化化骨髓瘤瘤细胞或或中国地地鼠卵细细胞(CCH0)，可在在其中表表达。为为了进一一步地消消除鼠抗抗体V区区框架区区(FWW)的异异源性，可可实行CCDR移移植(CCDR graaftiing)，以获获得与鼠鼠FW类类似的人人FW结结构的嵌嵌合抗体体。 噬噬菌体表表达的抗抗体仅含含V区(scFFv)或或Fabb片段，缺缺乏Fcc区，使使抗体的的稳定性性下

37、降，半半衰期缩缩短，与与Fc受受体结合合功能也也消失。因因此在抗抗体功能能片段的的末端连连接A蛋蛋白、酶酶、细胞胞因子、CCD4和和毒素等等分子，既既可增加加抗体片片段的稳稳定性，又又可发挥挥某些生生物学活活性功能能。 用用抗体基基因工程程方法获获得的抗抗体与效效应分子子交联物物比用化化学交联联法具有有优点：可以大大量生产产，不会会因修饰饰作用影影响抗体体及效应应分子的的活性，效效应分子子还可根根据需要要进行改改造。 此此外在抗抗体片段段的末端端连接一一段特异异的双亲亲性螺旋旋(ammphiiphiilicc heelixxes)结构，如如亮氨酸酸拉链结结构(lleuccinee ziippe

38、er)，可可使单价价的sccFv或或Fabb片段在在体内或或体外形形成稳定定的双分分子聚合合体，从从而提高高抗体片片段的亲亲和力。此此法也可可用于制制备双特特异性抗抗体。 44基因因工程抗抗体在真真核细胞胞中的表表达 噬菌体表表达的抗抗体片段段常常是是在原核核细胞(E.ccolii)中完完成。原原核系统统表达抗抗体片段段产量高，成本低低，快速速易于操操作。但但抗体片片段在原原核表达达系统中中不能进进行CHH2糖基基化，从从而影响响抗体的的活性。因因此重组组抗体基基因片段段可转移移至适合合的骨髓髓瘤细胞胞系或哺哺乳动物物细胞系系(如CCHO)，甚至至于植物物细胞中中表达，可可以得到到与淋巴巴细胞

39、表表达相同同的抗体体分子。免免疫球蛋蛋白IggA的重链和轻轻链及分分泌片基基因可以以分别转转化不同同的植株株，将表表达这些些蛋白的的植株进进行有性性杂交，在在杂交后后代中可可以装配配成完整整的IggA双分分子。以以植物作作为生物物反应器器进行抗抗体的表表达已有有许多成成功的研研究报道道，与动动物细胞胞相比更更为经济济，具有有广泛的的应用前前景。 四四、催化化性抗体体的制备备 11抗体体催化的的原理 119866年，由由PGGscchulltz和和RAALeerneer分别别领导的的两个小小组同时时证明抗抗体具有有催化活活性。针针对一个个四面体体带电荷荷的磷酸酸酯半抗抗原产生生的抗体体，能有有选

40、择性性地催化化相应的的碳酸脂脂和羧酸酸脂的水水解反应应。他们们将这种种有催化化活性的的抗体称称为催化化性抗体体(caatallytiic aantiiboddy)，又又称抗体体酶(aabozzymee)。催催化抗体体的作用用取决于于底物分分子水解解时的转转换态(traansiitioon sstatte)(图75)。转转换态的的分子结结构是分分子活化化后的一一种结构构状态，处处于转换换态的分分子具有有最高的的活化能能，分子子表现极极性。处处于这种种状态的的分子也也是最不不稳定的的，能与与这种分分子结合合的酶或或者抗体体会使某某些化学学键发生生断裂(如酯键键，碳键键，胺键键等)起起到酶解解作用。

41、可可见抗体体酶的作作用与天天然的蛋蛋白质酶酶非常相相似。抗抗体酶也也表现出出对底物物的专一一性，对对立体结结构的专专一性。在在饱和动动力学与与竞争性性抑制方方面都与与常规酶酶相似。所所以抗体体酶的发发现打破破了只有有常规酶酶才有的的分子识识别和加加速催化化反应的的传统概概念，为为酶工程程学开创创了新的的领域。 22抗体体催化的的化学反反应 由由抗体催催化的化化学反应应特异性性高于酶酶，但催催化速率率低于常常规的酶酶，只有有l033106倍。但但有一些些未发现现催化剂剂的反应应，如DDiellsAldder反反应也能能被抗体体催化。常常规酶一一般不能能催化胺胺键水解解，抗体体酶能使使胺键水水解的

42、速速度增加加25万万倍。讫讫今为止止，已发发现和证证明的由由抗体催催化的化化学反应应不下440种。 33催化化性抗体体的制备备 抗抗体酶是是抗原决决定簇处处于转换换态结构构的抗体体。因为为转换态态分子极极不稳定定无法制制备抗体体，所以以催化性性抗体的的获得主主要是通通过设计计稳定的的转换态态的类似似物作为为半抗原原，与载载体蛋白白交联后后，免疫疫动物，获获得针对对半抗原原的抗体体，从中中筛选具具有催化化活性的的抗体。筛筛选催化化性单克克隆抗体体所用的的ELIISA与与筛选一一般抗体体的方法法不完全全一样，应应根据催催化反应应的特点点而进行行适当的的修改。经经典的方方法是先先筛选出出与底物物或半

43、抗抗原结合合的抗体体，然后后从中再再筛选出出有催化化活力的的抗体，这这种方法法费时费费力。利利用催化化性抗体体对底物物的催化化活性，对对底物进进行适当当修饰，使使催化反反应的产产物可直直接表现现抗体的的催化活活性，这这样可以以简化检检测步骤骤。 转转换态类类似物半半抗原的的设计，必必须了解解催化反反应的转转换态模模型的结结构特点点。催化化抗体的的抗原结结合位点点上与转转换态互互补的某某些催化化基团的的形成，能能稳定转转换态分分子。此此外有人人把单克克隆抗体体分子用用化学修修饰方法法引入一一些活性性基团，提提高催化化性抗体体的催化化与亲和和效率。应应用噬菌菌体抗体体文库也也可以筛筛选催化化性抗体

44、体，可省省去制备备转换态态类似物物的复杂杂过程，直直接用底底物从文文库中筛筛选有催催化活性性的抗体体片段。如如用半抗抗原免疫疫后制备备的文库库或文库库经过多多次混杂杂重组，则则可以得得到更高高的亲和和力的催催化性抗抗体。抗抗独特型型抗体也也用于催催化性抗抗体的制制备，用用酶作为为抗原免免疫小鼠鼠获得能能够封闭闭酶活性性位点的的单克隆隆抗体，将将这个抗抗体用蛋蛋白酶除除去Fcc片段，用用Fabb免疫其其他品系系的小鼠鼠或家兔兔，得到到的抗体体具有相相应的酶酶催化活活性。 从从理论上上看，BB细胞具具有全套套免疫球球蛋白的的多样性性的胚系系基因，当当然也包包括有催催化作用用的自身身抗体在在内。然然

45、而19989年年Pauul WW.首次次报道了了人体的的一种能能催化蛋蛋白质水水解的免免疫球蛋蛋白。它它是种自身身抗体，能能水解血血管活性性肠肽(vassoacctivve iinteensttinaal ppepttidee，VIIP)的的Glnnl6Mett17键键。用VVIP作作为抗原原能得到到有催化化作用的的单克隆隆抗体，也也能催化化Glnnl6Mett17键键。大约约有177的人人有这种种自身抗抗体酶，但但患有气气喘的病病人中该该抗体与与VIPP的亲和和力比健健康人高高50倍倍。由于于VIPP是一种种气管松松弛剂，因因此有人人认为这这种VIIP自身身抗体的的长期作作用可能能与气喘喘的

46、过敏敏应答有有一定关关系。由由此推测测除了人人工设计计催化抗抗体以及及发现的的自身催催化抗体体外，用用筛选单单抗的方方法，也也有可能能找到所所需要的的催化抗抗体。第二节 抗原抗抗体反应应原理 抗抗体能特特异性地地识别相相应的抗抗原，并并与之结结合。这这种结合合在体外外也能发发生，这这种特性性就是许许多免疫疫检测方方法的基基础。抗抗原与抗抗体相互互作用是是非共价价的，可可逆的，其其特性符符合许多多化学反反应的基基本原理理。但因因为抗体体分子的的结构特特点，以以及抗原原分子结结构的多多样性，使使抗原抗抗体结合合反应表表现出复复杂性。 一、抗抗原抗体体作用的的热力学学与动力力学 11溶液液中抗原原抗

47、体的的化学平平衡 抗抗体与抗抗原的结结合是非非共价结结合，二二者在结结构互补补适应的的基础上上通过范范德华力力(vaan dder Waaals forrce)、静电电引力、氢氢键和疏疏水作用用等次级级键相互互作用。因因为结合合是可逆逆的，结结合与解解离的强强度在定条件件下取决决于抗原原与抗体体的亲和和力。如如果以SS代表抗抗体结合合位，即即互补位位(paarattopee)；以以L代表表抗原决决定簇；以SLL代表抗抗原与抗抗体的复复合物，则则抗原(Ag)与抗体体(Abb)在溶溶液中的的反应如如下： K+ K+AgAbb AggAb 即SL SL K KKSSL/SLK+/ KK 抗原抗体结结

48、合形成成的复合合物的浓浓度为SL，游离离的抗体体结合位位的浓度度为SS，抗抗原决定定簇的浓浓度为L。在在反应早早期复合合物形成成很快，一一定时间间后逐渐渐慢下来来，直至至复合物物的形成成与解离离达到平平衡(图图76)。此此时抗原原抗体复复合物的的浓度SL与游离离抗原表表位的浓浓度SS和游游离抗体体结合位位的浓度度L之比KK是平衡衡常数，又又称为内内在结合合常数，或或称内在在亲和力力(inntriinsiic aaffiinitty)。K+和K分别为结合和解离反应速度常数。 在在恒定的的条件下下，如温温度、ppH、离离子强度度等一定定时，KK是一个个常数。改改变抗原原或抗体的浓度，复复合物的的浓

49、度也也相应改改变以达达到新的的平衡，在在一定范范围内如如果SS与L增增加2倍倍，则SL应该增增加4倍倍，但实实际上会会少于44倍，因因为AggAb复复合物的的浓度SL是抗原原抗体的的一部分分。如果果上述浓浓度都以以摩尔浓浓度moolLL表示，则则是K的单位位为浓度度的倒数数(Lmoll)。如如抗体的的K在100710122 Lmool为高高亲和力力抗体，K低于107 Lmol为低亲和力抗体。 如如果以解解离常数数(K)描述述抗体的的亲和力力，比KK更简单单方便，KKd为KK的倒数数，即KKd11/K，单位位为mool/LL。Kd值越越大亲和和力越小小，Kdd越小亲亲和力越越大。 22抗原原抗体

50、反反应的自自由能变变化 抗抗原抗体体反应的的自由能能改变与与K相关：F0RTlnn K，KeF/RT，这这里R摩尔气气体常数数8.31JJ(mmolK)；T绝对温温度；lln自自然对数数；e自然对对数的底底数；F0标准准的自由由能变化化，规定定F01mmolSS与1mmol L形成成1mool SSL时自自由能的的变化。负负号表示示自由能能为负的的变化。 从从上式可可以估计计：当抗抗原抗体体结合亲亲和力增增加l00倍，则则1n110223003，337(3l015KK)时的的F05.94KKJmmol，温温度低于于37时F0更小。这这种自由由能变化化还不足足单个氢氢键的能能量(约约1881KK

51、Jmmol的的133。即使使亲和力力非常高高，K10100Lmool，F0只有55944KJmoll，仅相相当于33个氢键键的结合合能。当当抗原与与抗体间间形成氢氢键时，水水的氢键键被破坏坏，因此此每个氢氢键的净净能接近近于4.18KKJmmol。由由此可见见抗体与与抗原结结合时，吸吸力与斥斥力几乎乎相等，即即使在很很高亲和和力下，也也只有几几个千卡卡的微小小差别。因因而F的轻微微增加会会导致抗抗原抗体体结合的的亲和力力增高，这这就不难难理解当当抗原结结构发生生某些微微小改变变(如化化学修饰饰)时，会会引起抗抗原抗体体的亲和和力的很很大变化化。自由能对KK的影响响取决于于温度，然然而自由由能本

52、身身也受温温度的影影响： FF 0H 0TS 00H 0 为焓变变，S 00为熵变变，T为绝对对温度。K随温度的变化如下: dlnK /dTT=H 0 / RT2 或ddlnKK/d(1/TT)= H 0 /R 当当氢键和和极性键键形成时时，较大大的负焓焓变驱动动放热，亲亲和力会会随温度度的增加加而下降降。因此此抗原抗抗体相互互作用在在4比在255或37有更高高的亲和和力，可可见在给给定的浓浓度下，最最大眼度度的结合合在较低低温度下下达到的的。相反反，非极极性或者者疏水的的相互作作用受到到熵的影影响，TTS 00和H 0接近于于零，所所以这时时温度对对亲和力力影响较较小。 33.抗原原抗体反反

53、应的动动力学 抗抗原抗体体反应达达到平衡衡时的参参数测定定在实际际操作时时是困堆堆的。反反应完成成90，只需需几分钟钟或几小小时，而而从900至999则则需几倍倍的时间间，而欲欲达到99999完成成时所费费时则更更长，因因为此时时的AAg和和Abb已减减少到极极低的水水平。测测定一些些参数在在反应的的早期或或者未到到平衡时时是可行行的，利利用动力力学可以以计算出出抗原抗抗体反应应的特征征性参数数，用以以描述抗抗原抗体体反应的的规律： K+ Ag（S）Ab(L) AgAAb （SL） K 结合反应速速度KKSLM-1S-1 解解离反应应速度=K-SLLS-1达到平衡时时，则KK+SLK-SLL

54、KKK+K- KK+K-表明相相同亲和和力的抗抗体，其其结合速速度常数数和解高高速率常常数并不不一致。如如果K+和K-均很大大则抗原原抗体复复合物形形成很快快，但不不稳定；而K+和K-均小时时抗原抗抗体复合合物形成较慢，但但很稳定定。前者者适合于于亲和层层析，后后者适合合于标记记分析。 抗抗原抗体体结合成成复合物物后解离离的速度度常数(K-)取决决于结合合键的强强度。已已知抗体体的亲和和力和结合速速度常数数K+，根据据动力学学基本公公式KK+K-可以计计算解离离常速度度数K-。例如抗葡萄萄球菌核核酸酶的的抗体对对酶蛋白白抗原的的亲和力力是8.3l08Lmool，结结合速度度常数KK+41l05

55、 L(molls)，比比对半抗抗原的结结合常数数低。由由公式KKK+K-计算得得到K-4.910-44 L(molls)。然然后根据据公式tt1/221nn2KK-，计算算半解离离期(hhalfftiime forr diissoociaatioon)，得得到该抗抗体与抗抗原复合合物的半半解离期期为233minn。了解解抗原抗抗体复合合物的半半解离期期便可知知道结合合物在多多大的时时间范围围内稀释释而不影影响结合合物的解解离，这这对在免免疫亲和和层析等等许多其其他免疫疫方法的的应用中中有重要要意义。 抗抗原抗体体反应的的速度在在很大程程度上取取决于抗抗原分子子和抗体体分子的的扩散速速率及碰碰撞

56、的机机率。扩散速速度常数数用下式式表示： Kdll4D(610200) 为抗原原和抗体体分子半半经之和和(单位位为cmm)；DD为反应应系统中中抗原和和抗体分分子的扩扩散常数数之和(单位位为cmm2s)；610200为转换换函数，为为了把单单位转换换为L(mools)。例例如100-6cmm，D107cm2s，KKdl=7.55108L(mmols)。通通常大的的蛋白抗抗原比半半抗原与与抗体结结合的速速率要慢慢，大部部分蛋白白质的结结合速度度在1005106L(mmols)，而而理论上上限为1109 L(molls)。 二二、抗体体与单价价抗原的的作用 11抗体体亲和力力的测定定 抗抗体亲和和

57、力的测测定的方方法常采采用作图图法。抗抗原抗体体反应最最简单的的情况是是单克隆隆抗体与与单价抗原的反反应，如如半抗原原与单克克隆抗体体或单克克隆抗体体与大分分子抗原原上单一一的非重重复的位位点(抗抗原决定定簇)的的作用。以以最简单单的单克克隆抗体体与半抗抗原反应应为例的的作图法法，首先先用平衡衡透析(equiilibbriuum ddiallysiis)(图77A)来来测定系列游游离抗原原及结合合抗原的的浓度。根根据不向向抗原浓浓度进行平衡衡透析所所获得的的结合抗抗原，游游离抗原原。抗体体浓度是是已知的的。根据据这些数数据，进进行Scatccharrd分析析，即可可计算出出Ka的的值(图图77

58、B)。 SScattchaart分分析方法法是将KKaSL/SSLL分子子和分母母都除以以抗体的的浓度，SL/AAh=r,rr代表每个抗抗体分子子结合的的抗原(单价)分子数数SL/AAb=S/AAb.L(nnr)CC，SS/Ab;表示示每个抗抗体分子子上未被被抗原占占有的游游离抗体体结合位位的浓度度。这浓度实实际上是是抗体分分子上等等于全部部抗体结结合位(n)减减去以被被抗原占占据了的的结合位位数。因因为用的的是单价价抗原，因因此也就就是减去去结合的的抗原分分子数rr，即(nr)。这这里的nn实际上上代表抗抗体的价价数。CC在这里里代表抗抗原的浓浓度LL。由由此得到到公式： 当固定抗体体的浓度

59、度用不同同浓度的的抗原进进行一系系列的平平衡透析析实验，得得到一系系列相应应的r数数据，然然后根据据以r/C对rr作图。如如果所用用抗体是是均质的的（单克克隆抗体体），rr/C与与r的关关系为线线性关系系，它的的斜率即即为亲和和力Kaa（图777BB）。从从公式可可见，当当抗原的的浓度很很大的rr/C0，所以Ka（nnr）0或KKan=KKar,由由图77B可可见横坐坐标r的的截距就就等于抗抗体价nn。2亲和力力的异质质性 当当与单价价抗原结结合的抗抗体是多多克隆抗抗体时，其其Scaatchhardd图呈非非线性关关系(图图77B)。由于多克隆抗抗体来源源于多个个细胞克克隆，其其内在亲亲和力不

60、不同。内内在亲和和力的平平均值KKo常用用于表示异质的多多克隆抗抗体的亲亲和力，KKo为抗抗体结合合位点112被被占据时时的游离离抗原浓浓度。 33抗体体结合抗抗原的特特异性半抗抗原反应应抗体与单价价半抗原原反应的的特异性性极强，半半抗原上上化学基基团的细细小差别别或位置置的改变变，则与与抗体的的反应性性会表现现明显的的差别(图78)。抗抗体与同同源抗原原(hoomollogoous anttigeen)反反应最强强，与异异源抗原原(heeterroloogouus aantiigenn)反应应相对较较弱。有有些抗体体与异源源抗原的的反应比比同源强强，称为为变态抗抗体(hheteeroccli