钱中直-方法学验证-2课件

1、中药质量标准分析方法验证指导原则实施细则的介绍国家药典委员会钱忠直中国药典2005版一部新增指导原则中药质量标准分析方法验证指导原则中药注射剂安全性检查法应用指导原则中药分析方法验证实验项目现行方法回收率 精密度（仪器精密度） 重复性专属性 线性关系和线性范围 2005版药典一部指导原则准确性（回收率）精密度 重复性 中间精密度 重现性专属性检测限定量限线性范围耐用性与国际协调方法接轨（ICH）规范中药分析方法验证的实验内容中药方法学验证的特点反映被测成分与辅料间的影响与试验操作误差反映测定全过程误差的总和,特别包括其中提取、分离、转化反应等前处理过程所带来的误差由于中药所含成分复杂、含量偏低

2、，试验步骤较多，测定难度会更大，对精密度等影响会更大，一般难以达到常见的如化学药品的要求，且随着含量的高低和分离步骤的多少，可达到的要求会不同。 需验证的分析方法类型鉴别限量检查含量测定溶出度、释放度需控制的残留物、添加物等需验证的分析方法类型 准确度(Accuracy) 系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，有时也称真实度，一般用回收率(%)表示。 以经典方法的测定值作为真值，建立方法的测定数据与之比较（该法适用于化学单体药物） 以加入对照品测定的回收率表示，一般有空白回收（制剂空白）和加样回收测定的方法（中药材、复方制剂等） 准确度(Accuracy) 试验方法：同一样品，制备

3、相同浓度的6份样品（样品取样量减半，以1：1比例加入对照品）同一样品，制备3个浓度的供试品，每个浓度分别制备3份供试液，对照品的加入有以下3种方式：准确度(Accuracy)取相同量样品9份（一般为样品取样量的一半），设计 个浓度，按不同比例加入对照品。中间浓度一般按1：1比例加入，低、高浓度可选0.5：1、1.5：1的比例。加入的对照品的量要适当，保证供试品溶液的浓度（或量）在考察的线性范围内。取3个不同量的样品各3份，每个取样量分别按1：1比例加入对照品，中间浓度应选定在正常测定浓度，其他两个浓度可以结合范围考察的最高、最低点进行测定。按标示量计算的组分，可参照化学药品测定方法，取9份样品

4、，按0.8：1、1：1、1：1.2的比例加入对照品（样品取样量减半）。准确度(Accuracy) 测定数据的精度要求：一般应满足以下规定 回收率（%） 95105 相对标准偏差（RSD%） TLCS5%，HPLC/GC3% 准确度(Accuracy)感冒清热颗粒中葛根素含量测定回收率1编号样品含量(ug)加入葛根素的量(mg)测得葛根素总量回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)18819301853104.5297.223.812877178597.633875176495.594884176794.955883177395.76878176194.95准确度(Accuracy)感冒清热颗粒

5、中葛根素含量测定回收率3编号样品含量(ug)加入葛根素的量(mg)测得葛根素总量回收率(%)平均回收率(%)RSD(%522877930178597.6399.25 4.71 3875176495.591322845396.981422823245396.9897.991.7815229461100161322265695.631713211395264094.5595.030.58181319264394.91将序号1-3，13-18进行统计分析，结果平均回收率为97.42，RSD=3.22%。3种回收率试验方法比较 精密度（Precision） 精密度系指在规定的

6、测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度(离散程度) 精密度可以从三个层次考虑： 重复性(Repeatability) 中间精密度(Intermediate precision) 重现性(Reproducibility) 精密度考察应使用均匀稳定的、可信的样品。如果得不到，可用人为配制的样品进行研究。重复性(Repeatability) 重复性:在相同操作条件下，由同一个分析人员在较短的间隔时间内测定所得结果的精密度 重复性(Repeatability)实验要求： 在规定范围内，取同一浓度的样品，用6个测定结果进行评价； 或设3个不同浓度9份样品，用9个测定结果进行评

7、价（高低浓度可以结合范围的考察设计，中间浓度为样品平均浓度，计算9份样品的相对标准偏差）重复性(Repeatability)测定数据的精度要求：一般应满足以下规定 相对标准偏差(RSD%)TLCS5%，HPLC/GC3%。生丹颗粒中补骨脂素测定重复性2取样量（mg）补骨脂素量（mg）含量 (mg/g）含量平均值(mg/g）平均值(mg/g）含量（mg/袋）RSD（）2.50780.1509 0.060170.060030.061860.6192.820.1502 0.059892.50420.1472 0.058780.058700.14680.058622.50260.1514 0.0605

8、00.06046 0.1512 0.060425.00540.31150.06223 0.063350.32270.06447 5.00660.31890.06370 0.062980.31170.06226 5.01440.31790.06340 0.063480.31870.06356 7.50200.4570 0.060920.061630.4677 0.062347.5024 0.4748 0.063290.062840.4681 0.062397.51020.4808 0.064020.063260.4695 0.06251取样量（mg）补骨脂素量（mg）含量 (mg/g）含量平均值

9、(mg/g）平均值(mg/g）含量（mg/袋）RSD（）1.25710.0781 0.062130.062010.063180.6324.430.0778 0.06189 1.25000.0782 0.062560.062080.0770 0.06160 1.25940.0805 0.063920.063880.0804 0.063842.50780.1509 0.060170.060030.1502 0.059892.50420.1472 0.058780.058700.14680.058622.50260.1514 0.060500.06046 0.1512 0.060425.00540.

10、31150.06223 0.063350.32270.06447 5.00660.31890.06370 0.062980.31170.06226 5.01440.31790.06340 0.063480.31870.06356 7.50200.4570 0.060920.061630.4677 0.062347.5024 0.4748 0.063290.062840.4681 0.062397.51020.4808 0.064020.063260.4695 0.06251 12.46280.8309 0.066670.067830.85980.06899 12.64540.8453 0.06

11、6850.065860.8203 0.06487 12.4253 0.8477 0.068220.069330.8752 0.07044生丹颗粒中补骨脂素测定重复性3中间精密度(Intermediate precision) 在同一个实验室，不同时间由不同分析人员,用不同设备测定结果之间的精密度，称为中间精密度。考察的目的：考察随机变动因素对精密度的影响考察的变动因素: 不同时间 不同分析人员 不同设备 至少3人采用同一设备或同一人采用3台不同设备，对同一批样品测定含量。计算不同操作者或不同设备测定的含量平均值和相对标准偏差。 不能仅考察不同分析时间的结果，有重现性考察的，可以免做中间精密度。

12、重现性(Reproducibility) 在不同实验室由不同分析人员、不同设备测定结果之间的精密度 考察的目的：当分析方法将被法定标准采用时，应进行重现性试验目前阶段，该项试验可采用起草和复核试验的测定数据进行评价。但应由起草单位根据复核所的复核数据，报送两个实验室之间的相对标准偏差。报告的数据：标准偏差、相对标准偏差或可信限 由于中药有些被测成分属于痕迹量的,因此两个或两个以上实验室测定结果的偏差允许范围目前尚难确定。 专属性（Specificity）系指在一些可能存在的其他成分（包括杂质、降解物、基质等）存在时，采用的方法能准确可靠测定出药材、饮片、提取物及中药制剂中被测成分的能力。一种分

13、析方法缺乏专属性时，可由其他辅助的分析方法作补充。 专属性（Specificity）专属性有以下含义：鉴别：确证被测物是否符合其特性。检查：确保采用的分析方法可检出被测物中杂质或应控制物的准确含量，如有关物质、有毒成分、重金属、溶剂残留量等。含量测定：提供样品中被测物含量的准确结果。专属性（Specificity）鉴别 应能与可能共存的物质或结构相似化合物区分。不含被测成分的供试品，以及结构相似或组分中的有关化合物，均不得干扰测定 显微鉴别、色谱光谱鉴别等应附相应的代表性图象或图谱。 专属性（Specificity）含量测定和限量检查 色谱法和其他分析方法，应附代表性图谱，以不含被测成分的供试

14、品（除去含待测成分药材或不含待测成分的模拟复方）试验说明方法的专属性。并标明相关成分在图中的位置，色谱法中的分离度应符合要求。必要时可采用二极管阵列检测或质谱检测进行验证专属性（Specificity） 常用的试验方法: 空白阴性对照试验 比较同一分析系统对照品与供试品相应色谱峰的吸收光谱的一致性 色谱-质谱联用验证待测成分空白阴性对照试验的试验要求 TLC：目测观察，空白阴性对照应不得显与供试品检测成分相应的斑点。 HPLC/GC/TLCS：空白阴性对照色谱中，在与相应对照品保留时间相应的位置应无色谱峰或其峰面积小于5%空白阴性对照试验 除去待测药味，按规定的制法制成空白样品，按测定方法同法

15、制备空白阴性对照溶液 测定成分为2种以上药材含有的，应分别制备每一药味的空白，及减去含有共同成分药味制备的空白检测限（Limit of Detection，LOD) 检测限系指供试品中被测物能被检测出的最低量。试验方法：直观法仪器法（信噪比法） 检测限试验方法采用已知浓度的对照品进行试验直观法 如薄层色谱检测成分的检出量或毒性成分检出限量的确定。在薄层板上，以已知浓度的对照品点样，依法展开、显色后目测观察，可检出的最小量为检测限。信噪比法 信噪比（S/N）为3：1的样品的浓度（或量）。以已知浓度（或量）的对照品溶液进样，峰高值为3倍噪音时的对照品浓度为检测限。噪音的测量，可以空白溶剂进样，记录

16、相应长度的色谱基线，测量相当于对照品保留时间前后适当距离的噪音高度即可。定量限（Limit of Quantitative, LOQ） 定量限系指供试品中被测成分能被定量测定的最低量，其测定结果应具一定准确度和精密度。 试验方法：一般以10倍于噪音的对照品溶液重复点样或进样5-6次，计算重复点样或进样的峰面积值的RSD%。当RSD%3%（薄层扫描法）或2%（高效液相色谱法/气相色谱法）的浓度（或量）为方法的定量限。若RSD%较大，应重新调整对照品溶液的浓度，进行测定。线性（Linearity） 线性系指在设计的范围内，测试结果与供试品中被测物浓度直接呈正比关系的程度。 试验方法制备梯度浓度对照

17、品溶液，以相同体积点样或进样测定峰面积值，制备标准曲线，并以峰面积值与对照品浓度（或量）作线性回归，计算线性方程和相关系数。制备同一浓度的对照品溶液，以不同体积点样或进样测定，同法处理。线性测定的浓度应尽量在一较宽的范围，至少应大于范围中的高低限浓度区间。计算相关系数，要求： TLCS：R0.99，HPLC-UV：R0.999，HPLC-ELSD：R0.995。 范围（Range） 范围系指能达到一定精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。 考察的区间应尽可能覆盖日后样品可能的含量范围验证试验过程中除取样量和进样量可改变外，一般不得改动实验操作过程中规定的如溶剂体积、提取时间

18、、萃取次数等。范围（Range）可结合准确度试验进行，并以高、低限浓度的精密度进行评价。一般可在准确度试验的高低两个浓度点各加测3份样品，分别计算高、低浓度点6份样品的RSD%值，并满足以下规定TLCS法RSD% 5%，HPLC/GC法 RSD% 3%。范围（单体药物）实验项目限度范围含量测定标示量90-110%80-120%杂质检查限度值限度值的50-120%溶出度限度值限度值的20% 含量均匀度测试浓度测试浓度的70-130% 范围（中药和复方制剂）含量限度有上下限的，一般设定范围低限为含量限度下限的5070，范围的高限为含量限度上限的130150。含量限度仅有低限的，一般设定范围为含量限度的5070至含量限度的25倍以上。以标示量规定含量限度的，可参照化学药， 一般设定范围为标示量的80120。 耐用性（Robustness） 耐用性系指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为把方法用于常规检验提供依据 开始研究分析方法时，就应考虑其耐用性。如果测试条件要求苛刻，则应在方法中写明 耐用性（Robustness）典型的变动因素 被测溶液的稳定性 样品提取方式 时间 典型的变动因素（液相色谱法）不同品牌或不同批号的同类型色谱柱 （至少采用3根不同商品规格的色谱柱，测定同一批样品溶液的含量，计算含量值和RSD%。应提供不同柱分离的色谱图，计算理