构建IL2优化的免疫球蛋白抗淋巴瘤基因疫苗

1、构建IL-2优化的免疫球卵白抗淋巴瘤基因疫苗刘辉常乃柏爱惜春朱平【摘要】本研究构建白介素2IL-2基因与免疫球卵白重链可变区IgHV基因共表达的基因疫苗。从淋巴瘤患者外周血得到免疫球卵白基因IgHV片断，将其与IL-2基因毗连后形成的交融基因克隆到真核表达载体中。表达载体通过脂质体转染S细胞，用ELISA法检测IL-2的表达。效果表现：本研究乐成构建了IgHV基因与IL-2基因的交融基因表达载体。在IgHV-IL-2/pDNA3.0中IL-2可以得到准确表达。结论：本研究构建的IL-2和IgHV的交融表达载体可以在S细胞中排泄表达IL-2。【关键词】基因疫苗白介素2淋巴瘤nstrutinfFu

2、sinGeneBeteenIgGHVandIL-2asIgHVNulEiAidVaineAgainstLyphaKeyrdsgenevaine;IL-2;Lypha在淋巴瘤的治疗中放疗和化疗起着非常紧张的作用，但放疗和化疗都伴有较严峻的副作用，探求副作用小并能根治淋巴瘤的要领不停是研究的热门，特异性免疫治疗的生长为淋巴瘤患者提供了盼望。使用淋巴瘤外貌特有的免疫球卵白奇特型作为抗原制备的DNA疫苗可以或许诱导机体产生抗淋巴瘤的免疫反响。但DNA疫苗在体内不克不及自我复制，转化服从低，故DNA疫苗的免疫服从难以令人满足，探求符合的免疫佐剂是加强基因疫苗免疫活性的紧张本领。IL-2是一种紧张的T细胞

3、生长因子，在操纵帮助T细胞的分化上起关键作用，能加强自然杀伤细胞NK,细胞毒T细胞TL的成效，促进T细胞增殖和滋扰素IFN的产生。赐与抗原后注射IL-2可加强免疫反响，但细胞因子具有多效性，满身赐与治疗量的细胞因子固然可以加强免疫反响，但副作用较多。注射编码细胞因子的质粒可在免疫反响的局部连续开释低剂量的细胞因子，如许既可加强免疫反响，又能减轻毒性。因此构建IL-2和特定抗原的共表达载体大概是进步DNA疫苗服从的有用途径。文献报道，同时表达IL-2的DNA疫苗比不表达IL-2的疫苗免疫效应超过100倍1。为此，本研究克隆了免疫球卵白重链可变区IgHV基因片断，构建IgHV与细胞因子IL-2的共

4、表达载体，不雅察其在S细胞中排泄表达IL-2。质料和要领IgHV真核表达载体的构建从1例淋巴瘤患者外周血中构建免疫球卵白基因IgHV克隆2，上游引物方案在IgHV的引导区内，5端方案了Kzak序列及KpnI的酶切位点；卑劣引物方案在它的FR3区，5端方案了停顿暗码子及ERI的酶切位点，序列如下本实行所用引物均由上海博亚生物技能合成：VH上:5-TATAGGTAAATGGAGTTTGGGTGAGTG-3，VH下：5-TTAAGAATTTAAGTGAAGTAATAAGGGT-3。PR反响按通例操纵举行。PR产物经KpnI和ERI酶切后，定向克隆到真核表达载体pDNA3.0中。拔取阳性克隆测序上海博

5、亚生物技能。IgHV和IL-2交融基因真核表达载体的构建PR得到3端含讨论linker的IgHV基因片断上游引物与VH上雷同，卑劣引物在它的5端方案了包罗编码10个亲水性并有低电荷效应的氨基酸序列作为讨论，序列如下：VH下:5-AGAGTGAGGATAGAAGTGAAGTAATAAGGGT-3。PR得到5端含linker的IL-2基因片断用PD-hIL-2质粒北京大学医学部免疫教研室马大龙传授惠赠作为模板扩增hIL-2基因(399bp)，在IL-2基因上游引物5端方案了包罗编码10个亲水性并有低电荷效应的氨基酸序列作为讨论，卑劣引物5端方案了停顿暗码子及ERI的酶切位点，序列如下：hIL-2上

6、：5-GGTGGGGTGGATGGTGGGGAGGTTGATATTAAGTTTAAAAG-3，h-IL-2下：5-TTAAGAATTTAAGTTAGTGTTGAGATGATG-3。按通例举行PR反响。将IgHV基因片断与IL-2基因片断经Klen片断毗连形成交融基因，定向克隆到真核表达载体pDNA3.0中构建IgHV和IL-2交融基因真核表达载体。拔取阳性克隆测序上海博亚生物技能。将IgHV/pDNA3.0和IgHV-IL-2/pDNA3.0在TP10菌中大量扩增，用QIAgenGiga无内热源质粒提取试剂盒大量提取质粒。IL-2交融基因真核表达载体在细胞中的表达通过脂质体介导法瞬时转染S细胞

7、非洲绿猴肾细胞系，在6孔板上接种2105S细胞2l/ell，372造就箱中造就24小时后每孔细胞贴壁约60，细胞生长状态好。IgHV-IL-2/pDNA3.0各复种2孔，以pDNA3.0空质粒复种2孔作为阴性比较。根据Invitrgen公司提供的转染步伐举行，脂质体LipfetiDNA为31V/,导入外源DNA2g/ell。转染48小时后取造就上清，通过双抗体夹心ELISA法检测上清中的IL-2表达量。效果得到IgHV真核表达载体所选择的淋巴瘤患者的外周血经PR后得到其IgHV基因片断，长度约为350bp摆布，克隆后得到IgHV/pDNA3.0，经KpnI和ERI酶切之后出现预期条带，乐成地构

8、建了IgHV真核表达载体，基因序列如下：略注：黑框内的序列为ATG起始暗码，下划线序列为停顿暗码。得到IgHV和IL-2交融基因真核表达载体经PR得到在5端包罗编码10个氨基酸序列讨论的IgHV片断，长度约380bp摆布；得到在3端包罗编码10个氨基酸序列讨论的IL-2片断，片断长度为429bp；将IgHV片断与IL-2片断毗连后得到IgHV-IL-2交融基因片断，片断长度约800bp，克隆后得到IgHV-IL-2/pDNA3.0。表达载体质粒经KpnI和ERI酶切后出现预期条带附图。将交融基因质粒举行双向测序，效果表现交融基因序列完全准确，无移码突变和碱基错配。IL-2交融基因真核表达载体在

9、细胞中的表达用ELISA检测了转染S细胞48小时后造就上清中IL-2的表达量。效果表白，转染IgHV-IL-2/pDNA3.0的造就上清中IL-2的表达量高于比较组空质粒pDNA3.060倍以上附表。这说明IgHV-IL-2/pDNA3.0可在体外临时表达并排泄IL-2。讨论人们在对奇特型疫苗的研究中创造，单纯的奇特型疫苗仅能诱导出低度的抗奇特型抗体，不敷以引发抗肿瘤庇护作用，这提示疫苗的免疫原性较弱，必要与免疫加强剂偶联。研究证明，IL-2、IL-4、G-SF、IL-1、IP10、P-3等均有免疫加强的作用3-6。为了进一步加强细胞因子的免疫作用，aeker等4将VA基因与细胞因子共表达于同一载体质粒，质粒可以在体外表达VA细胞因子交融卵白，后者注射给小鼠均能诱导出VA较强的特异性细胞毒反响，并且诱导出的免疫反响较别离注射VA基因和细胞因子基因强。因此，为了加强免疫反响，我们将IL-2与IgHV3框架区基因构建于同一载体中，使细胞因子在最适的部位表达，从而高效地发挥其免疫加强作用，在构建IgHV-IL-2交融基因时，我们在引物中方案了包罗编码10个亲水性并有低电荷效应的氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser作为讨论。甘氨酸布局简朴，易于折叠，对交融卵白的立体构象影响小，从而