水粪大肠菌数检测(业内借鉴)课件

1、09工业环保与安全技术水总大肠菌群检测09工业环保与安全技术水总大肠菌群检测工作流程实验工作流程实验理论知识讲解仪器使用说明书安全注意事项2专业课件工作流程实验工作流程实验理论知识讲解仪器使用说明书安全注意事工作流程实验流程分组取样依单卡领物品实验返还物品提交报告3专业课件工作流程实验流程分组取样依单卡领物品实验返还物品提交报告3专 当环境受到污染后，环境的 物理性质 化学性质 生物学特性 如：重金属离子、NO3- 浓度增加；水体污染变质，水生生物种类减少，甚至灭绝；发生变化理论知识4专业课件 当环境受到污染后，环境的发生变化理论知识4专业课件如何监测？化学方法：快速、定性定量反映污染物浓度，

2、但为瞬时值； 生物学方法：利用生物种类、数量的变化，生物学特性的改变来监测污染物对环境的影响。可监测到污染物对环境的综合影响，但不易精确反映污染物的性质、浓度和数量。5专业课件如何监测？化学方法：快速、定性定量反映污染物浓度，但为瞬时值生活饮用水卫生标准2006年12月29日，卫生部、国家标准化委员会发布2006年第12号文件，批准发布生活饮用水卫生标准及检测方法国家标准。标准自2007年7月1日起实施，其中生活饮用水卫生标准中非常规指标的实施项目和日期由省级人民政府根据当地实际情况确定。全部指标最迟于2012年7月1日实施。6专业课件生活饮用水卫生标准2006年12月29日，卫生部、国家标饮

3、用水中微生物指标项目单位限值说明总大肠菌群MPN/100mL或CFU/100mL不得检出一般性污染耐热大肠菌群MPN/100mL或CFU/100mL不得检出指示粪便污染大肠埃希氏菌MPN/100mL或CFU/100mL不得检出指示粪便污染菌落总数CFU/mL100一般性污染贾第鞭毛虫个/10 L1肠道原虫隐孢子虫个/10 L1肠道原虫7专业课件饮用水中微生物指标项目单位限值说明总大肠菌群MPN/100m新国标常规项目限值变化原国标新国标砷0.05 mg/L0.01 mg/L镉0.01 mg/L0.005 mg/L铅0.05 mg/L0.01 mg/L硝酸盐（以N计）20 mg/L10 mg/L

4、浊度3度1NTU8专业课件新国标常规项目限值变化原国标新国标砷0.05 mg/L0.0 检品 胆盐乳糖发酵管 伊红美兰平板 大肠杆菌菌落纯培养 乳糖复发酵管（-） 乳糖复发酵管（） 大肠菌群的检测流程9专业课件大肠菌群的检测流程9专业课件总大肠菌群当饮用水受到粪便等污染，就有可能带有沙门氏菌、志贺氏菌、弧菌、肠道病毒等，且它们均可以水为媒介引起肠道传染病。总大肠菌群含量可表明水体被污染的程度，并且间接地表明肠道病菌存在的可能，以及对人体健康具有潜在危险性。 10专业课件总大肠菌群当饮用水受到粪便等污染，就有可能带有沙门氏菌、志贺粪大肠菌群粪大肠菌为总大肠菌群的一个亚种；直接来自粪便，除了它耐热

5、，在44-44.5的高温条件下仍可生长繁殖并将色氨酸代谢成吲哚，其他特性均与总大肠菌群相同。由于总大肠菌群既包括粪便污染，同时也包括非粪便污染的大肠菌总数，因此，有必要在饮用水标准中增加粪大肠菌群这个指标，以便直接反映出水体是否受到粪便污染的信息，进一步确保流行病学的安全。11专业课件粪大肠菌群粪大肠菌为总大肠菌群的一个亚种；直接来自粪便，除了粪大肠菌群检测方法注解 总大肠菌群中的细菌除生活在肠道中外，在自然环境中的水与土壤中也经常存在，但此等在自然环境中生活的大肠菌群培养的最合适温度为25左右，如在37培养则仍可生长，但如将培养温度再升高至44.5，则不再生长，而直接来自粪便的大肠菌群细菌，

6、习惯于37左右生长，如将培养温度升高至44.5仍可继续生长。 因此，可用提高培养温度方法将自然环境中的大肠菌群与粪便中的大肠菌群区分。在37培养生长的大肠菌群，包括在粪便内生长的大肠菌群称为“总大肠菌群”(Total coliform)；在44.5仍能生长的大肠菌群，称为“粪大肠菌群”(Fecal coliform)，粪大肠菌群细菌在卫生学上具有重要的意义。12专业课件粪大肠菌群检测方法注解 总大肠菌群中的细菌除生活在目的：1.学习水样的采取方法和水样总大肠菌菌群测定的方法；2.了解水源水的平板菌落计数的原则。13专业课件目的：1.学习水样的采取方法和水样总大肠菌菌群测定的方法；1水中总大肠菌

7、群的测定一、测定意义 作为水体受粪便污染的指标。 二、总大肠菌群的特征 在37 48h之内发酵乳糖产酸产气 是革兰氏阴性无芽孢杆菌 在特殊培养基上能够长出具有典型特征的菌落 14专业课件水中总大肠菌群的测定一、测定意义 作为水体受粪便污染的指标。实验原理：目前检测大肠菌群的标准分析法是多管发酵法。多管发酵法包括初步发酵试验，平板划线分离和复发酵试验三部分。15专业课件实验原理：目前检测大肠菌群的标准分析法是多管发酵法。15专业 水中总大肠菌群的测定 总大肠菌群:指那些能在37 48h之内发酵乳糖产酸产气的、需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性的无芽孢杆菌。主要包括有埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、克

8、雷伯氏菌属等菌属的细菌。 生活饮用水的总大肠菌群数每升不得超过3个16专业课件 水中总大肠菌群的测定 总大肠菌群:指那些能在37 48h水中总大肠菌群的测定一、多管发酵法 (1) 生活饮用水 初发酵试验 平板分离 复发酵试验 阳性管接种在伊红美兰培养基上，37培养1824h，挑选典型特征的菌落，涂片、革兰氏染色、镜检 各100mL原水样各10mL3724hG-G-G+3718-24h3724h17专业课件水中总大肠菌群的测定一、多管发酵法 (1) 生活饮用水 (2) 水源水：将水样作1：10稀释 水样25mL225mL无菌水各1mL各1mL各10mL10-13724h水源水大肠菌群的测定18专

9、业课件(2) 水源水：将水样作1：10稀释 水样25mL225mL(3) 地表水和废水：水样应作1:10，1:100，1:1000或更高的稀释 MPN值=MPN指数 水源水大肠菌群的测定19专业课件(3) 地表水和废水：水样应作1:10，1:100，1:10水源水大肠菌群的测定1.初发酵试验 水样25mL225mL无菌水各1mL各1mL各10mL10-1EC培养液3724h44.52448h20专业课件水源水大肠菌群的测定1.初发酵试验 水样25mL225mL无2.复发酵试验 阳性管接到EC培养液中。在37温度下培养24h2h，立即观察，发酵管产气则证实为大肠菌群阳性 3.计算和报告结果 查M

10、PN表，按总大肠菌群的计算方法计算每升水中粪大肠菌群细菌的MPN值 水源水大肠菌群的测定21专业课件2.复发酵试验 阳性管接到EC培养液中。在37温度下培养2检测操作方法检品取样培养基配制灭菌与消毒接种培养与计数22专业课件检测操作方法检品取样培养基配制灭菌与消毒接种培养与计数22专检品取样1.水体取样： 应取距水面1015cm的深层水样。先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水立即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出。2. 自来水取样： 打开自来水龙头，让水流流出1min左右，用烧杯接取自来水。23专业课件检品取样1.水体取样：23专业课件3. 将河水水样分

11、别稀释成10-1、10-2、10-3三个连续稀释浓度（注意：在稀释前后一定要充分混匀）、自来水样不稀释。 注意：河水样的稀释，取1个灭菌空试管，加入9mL灭 菌水。用取过灭菌水的移液管取1mL河水样，放入试管中，振荡试管混合均匀。 检品取样24专业课件3. 将河水水样分别稀释成10-1、10-2、10-3三个连或者是品红亚硫酸钠培养基。生长特征菌落。发酵（产酸产气）EC肉汤配方：胰蛋白胨20g/l乳糖5g/l3号胆盐1.5g/lK2HPO4 4g/lKH2PO4 1.5g/lNaCl 5g/lpH：7.0初发酵（产酸产气）EC肉汤伊红美兰培养基3倍EC肉汤培养基配制25专业课件或者是品红亚硫酸

12、钠培养基。生长特征菌落。发酵（产酸产气）初发品红亚硫酸钠培养基（Endo Agar）（远藤琼脂培养基）26专业课件品红亚硫酸钠培养基（Endo Agar）（远藤琼脂培养基）2品红亚硫酸钠培养基平板及典型菌落27专业课件品红亚硫酸钠培养基平板及典型菌落27专业课件伊红美蓝培养基 蛋白胨 10g乳糖 10g磷酸氢二钾 2g琼脂 2030g蒸馏水 1000ml2%伊红水溶液 20ml0.5 %美蓝水溶液 13ml 28专业课件伊红美蓝培养基 蛋白胨 10g28专业课件灭菌与消毒灭菌1.无菌操作中需要用到的器具需灭菌，如取样瓶、培养皿、涂布棒等；2.培养基需灭菌；3.无菌水需灭菌。消毒1.接种前，空气

13、环境需紫外线消毒；2.无菌操作时，手需酒精消毒29专业课件灭菌与消毒灭菌1.无菌操作中需要用到的器具需灭菌，如取样瓶、1.加热已经配制好的固体培养基（牛肉膏蛋白胨琼脂培养基），使固体培养基溶化。2.倒制平板：每个空平皿中倒约20mL的培养基，放置桌面待其凝固。3.用移液管吸取0.1mL水样，滴于平板中；将玻璃涂布棒于酒精灯的外焰上加热，杀死表面微生物，待其冷却后用涂布棒将水滴均匀的涂满整个平板表面，尽量将水涂干。5. 倒置于37度培养箱中培养24h。涂布平板接种法：30专业课件1.加热已经配制好的固体培养基（牛肉膏蛋白胨琼脂培养基），使涂布平板接种法：31专业课件涂布平板接种法：31专业课件

14、1.挑取无片状菌苔生长的平板作为计数平板，若片状菌苔的大小不到平板的一半，而其余的一半菌落分布很均匀时，可将此一半的菌落数乘2以代表全平板的菌落数。 2.选择平均菌落数在30-300之间的平板来计算该水样的菌落总数。如果所有的平板的菌落总数都不在30-300范围之内，则取最靠近30-300的平板进行计数 3. 如果有两个稀释浓度的总菌落数落在了30-300范围之内，则先计算两个浓度下每ml水体中细菌总数，如果两个数值的比值大于2则取小的浓度，如若小于2则取两值的平均值。菌落计数32专业课件菌落计数32专业课件33专业课件33专业课件10-110-210-3细菌总数（个/mL)156215213

15、246822640261321856无法计数354731928104无法计数30312试一试 34专业课件10-110-210-3细菌总数15621521324682例次不同稀释度的平均菌落数两个稀释度菌落数之比菌落总数/CFUmL-1报告方式/ CFUmL-110-110-210-31234561 3652 7602 890无法计算27无法计算1642952711 650113052046605135121.62.216 40037 75027 100513 00027030 50016 000或1.610438 000或3.810427 000或2.7104510 000或5.110527

16、0或2.710231 000或3.1104计算和报告计数结果 35专业课件例次两个稀释度菌落总数/CFUmL-1报告方式/ CFU计算根据证实有大肠菌群存在的阳性发酵管，查MPN检索表，求出每100ml水样中的大肠菌群数。MPN表见P19236专业课件计算根据证实有大肠菌群存在的阳性发酵管，查MPN检索表，求出大肠菌群测定 国家标准采用三步法 大肠菌群 需氧及兼性厌氧、在37能分解乳糖产酸产气的革 兰氏阴性无芽胞杆菌。 乳糖发酵试验分离培养证实试验样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。361培养482h，观察是否产气。 将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，361

17、培养18-24h，观察菌落形态。挑取平板上的可疑菌落，进行革兰氏染色观察。同时接种乳糖发酵管361培养242h，观察产气情况。 根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MPN表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值。 37专业课件大肠菌群测定 国家标准采用三较清洁样品的三步法图示 100mL50mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液100mL5mL5mL5mL5mL5mL5mL5mL5mL5mL5mL水样10mL10mL10mL10mL10mL10mL10mL10mL10mL10mL38专业课件较清洁样品的三步法图示 100mL50mL三倍浓缩乳糖蛋白胨三步法图示 取产酸产气的发酵管中培养液在伊红美兰平板上

18、进行划线取有核心和带金属光泽的深紫色菌落进行革兰氏染色乳糖蛋白胨培养液镜检（革兰氏阴性菌）37 培养48h证实产气（阳性）结果与否37 培养24h37培养24h 39专业课件三步法图示 取产酸产气的发酵管中培养液在伊红美兰平板上进行划大肠菌群测定 计算方法 挑选菌落特征：黑紫色、有光泽或无光泽菌落； 红色、粉红色菌落。抑制剂：胆盐、煌绿、十二烷基硫酸钠。 为阴性结果的水样体积（mL）全部水样体积（mL） MPN 1000为阳性结果的发酵管（瓶）的数目 产酸判断：紫色培养液变成黄色产气判断：发酵导管内有小气泡，如轻轻打动试管有气泡沿管壁 上浮，应考虑可能有气体产生，需进一步试验。 40专业课件大肠菌群测定 计算方法 挑选菌落特征：黑紫色、有光泽或无光泽美国FDA标准方法行业标准采用两步法：用于对出口食品中大肠菌群进行检验 推测试验证实试验样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管LST肉汤发酵管。361培养482h，观察是否产气。 将产气发酵管培养物转种于煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤中，361培养482h ，观察是否产气。以BGLB产气为阳性，查MPN表，报告每ml（g）样品中大肠菌群的MPN值。 41专业课件美国FDA标准方法行业标准采用两步法：用于对出口食品中大 如对一自来水厂出水进行检验，初发酵一般