免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测培训课件

1、免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测Part I 补体参与的反应 补体的溶血反应 Part II T细胞数量及其功能检测 E花环形成试验数量测定 淋巴细胞转化试验： 形态学方法 3HTDR掺入法 MTT比色法 功能2免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测Part I 补体参与的反应功能2免疫学补体参和反应 补体激活的三条途径经典途径MBL途径旁路途径IC+C1qMBL+病原体配基细菌+C3膜攻击复合物细胞溶解Part I 补体参与的反应复习3免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测 补体激活的三条途径经典途径MBL途径旁路途径IC+1.补体的溶血反

2、应 原理 绵羊红细胞（SRBC ）作为抗原与其相应抗体（溶血素）结合后，通过经典途径激活补体，产生膜攻击作用，最后导致红细胞溶解，发生溶血反应。 材料 1抗原：2%绵羊红细胞； 2抗体(溶血素)； 3补体：健康豚鼠新鲜血清 4生理盐水、24孔板等。 4免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测1.补体的溶血反应 原理4免疫学补体参和反应T细胞数量和其孔号 SRBC溶血素补体NS13滴3滴3滴3滴23滴3滴6滴33滴3滴6滴43滴9滴 步骤1、取24孔板，按下表加入各成分； 2、将24孔板放在37温箱内15-30min，观察并记录结果。结果:5免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测孔号 SRBC

3、溶血素补体NS13滴3滴3滴3滴23滴3滴6Part II T细胞数量及其功能检测6免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测Part II T细胞数量及其功能检测6免疫学补体参和2.E花环形成试验 原理人外周血T细胞表面具有天然的能与绵羊红细胞(SRBC)表面糖肽相结合的受体E受体（CD2分子），可结合SRBC形成花环样细胞团，是T细胞特有的表面标志。 检测T细胞数量，间接判断机体的细胞免疫状况 。7免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测2.E花环形成试验 原理 检测T细胞数量，间接判断机体的免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测培训课件 步骤： （动作轻柔；分清滴管及枪头！）取肝素抗凝血

4、与等量Hanks液稀释混匀血3ml，用滴管贴管壁（倾斜30）轻轻叠加于3ml分离液上（界面要清晰） 配平后1800rpm离心13mins。 1.淋巴细胞悬液的制备：人淋巴细胞比重：1.070淋巴细胞分层液：1.077人红细胞比重：1.0929免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测 步骤： （动作轻柔；分清滴管及枪头！稀释的血液 分层液离心前稀释的血浆 单个核细胞分层液粒细胞红细胞离心后10免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测稀释的血液 离心前稀释的血浆 离心后10免疫学补体参和反应T11免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测11免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测 另取一支滴管，仔

5、细吸出位于血浆和分离液之间的乳白色的单个核细胞，放入盛有5mlHanks液的试管2000rpm离心5mins。(3)弃上清（倾倒时液体不要回流），将沉淀的淋巴细胞轻弹混匀后加入Hanks液5ml，重复离心两次。2.弃去上清，留经过洗涤的淋巴细胞悬液（约0.1ml）与绵羊红细胞0.1ml 、1640营养液0.1ml混合（分清枪头）轻弹混匀后放于37温箱15mins。离心时要配平12免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测 另取一支滴管，仔细吸出位于血浆和分离液之间的乳白色的3. 取出试管，500rpm离心5mins。（注意此步非常关键，转速一定要慢，一启动即关，来回数次即可）,室温静置2-3mi

6、ns4. 吸去100-150ul上清液，轻轻旋转混匀，沿管壁滴加1滴(50ul)戊二醛，轻轻混匀静置5mins。5. 取一滴（25ul）液体滴片，加一滴灿烂甲酚兰染液，加盖玻片。13免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测3. 取出试管，500rpm离心5mins。（注意此步非常关6.高倍镜下观察，计数100个淋巴细胞，计算花环形成率。淋巴细胞上结合3个SRBC者为E花环阳性。正常参考值：EtRFC：64.46.7； EaRFC：23.63.5； EsRFC：3.32.614免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测6.高倍镜下观察，计数100个淋巴细胞，计算花环形成率。淋巴 结果T 淋巴细胞S

7、RBC15免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测 结果T 淋巴细胞SRBC15免疫学补体参和反应T细胞数量16免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测16免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测淋巴细胞转化试验 原理 T细胞在体外培养时，受到非特异性有丝分裂原(如PHA、ConA)或特异性抗原刺激后，可出现代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加、细胞体积增大并能进行分裂的淋巴母细胞，称淋巴细胞转化现象。淋巴细胞转化率的高低，可反映机体的细胞免疫水平，故可作为测定机体免疫功能的指标。三种方法形态学方法、 3H-TdR掺入法、 MTT比色法17免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测淋巴细胞转化试验 原

8、理17免疫学补体参和反应T细胞数 根据胞核的大小、核与胞浆的比例、胞浆染色性、核的构造与核仁的有无。成熟小淋巴细胞：核染色深、没有核仁，胞浆少、染色为轻度嗜碱性；过渡型淋巴细胞：大于小淋巴细胞、核染色比较疏松，胞浆比较多，但是出现核仁；淋巴母细胞：体积增大，形态不规则，核变大、核质染色疏松，有核仁12个，胞浆丰富，常出现胞浆空泡；其他细胞：中性粒细胞在培养72消失后，绝大部分衰变或死亡呈碎片。形态学方法：镜下观察 淋巴细胞转化试验18免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测 根据胞核的大小、核与胞浆的比例、胞浆染色性、核的构造淋巴细胞转化率：转化的淋巴细胞转化的淋巴细胞未转化的淋巴细胞100正

9、常参考值：80红细胞未转化淋巴细胞转化的淋巴细胞淋巴细胞转化实验 瑞氏染色 1040 19免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测淋巴细胞转化率：转化的淋巴细胞转化的淋巴细胞未转化的淋巴细20免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测20免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测3HTDR掺入法 淋巴细胞转化试验 T细胞受到PHA或特异性抗原刺激后，发生有丝分裂，细胞进入S期，此时在细胞培养液中加入氚标记的胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TDR)，可以被细胞摄入而掺入DNA中，通过-液体闪烁计数器测定3H-TDR的掺入量，判断细胞的增殖程度。 21免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测3HTDR掺入法

10、MTT比色法 淋巴细胞转化试验 MTT为一种黄色可溶性物质，细胞活化增殖时通过线粒体能量代谢，将MTT代谢成蓝紫色的甲臢，沉积于细胞内或细胞周围，形成甲臢的量与细胞活化增殖的程度呈正比。甲臢经盐酸异丙醇溶解后呈紫蓝色，置于酶标仪下根据显色程度即可知道甲臢量并反映细胞活化程度。 22免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测MTT比色法 淋巴细胞转化试验 MTT Formazan Insoluble23免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测 MTT Formazan Insoluble23免疫学1. 补体溶血反应的原理、步骤、结果及分析。2. E花环形成试验的原理、步骤、绘制镜下观察结果。3. 绘制淋巴