实验技术全过程

1、WesternblotWesternblot全过1 Western（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗WesternBlotPAGE（例如硝酸纤维素薄膜也广泛应用于检测蛋白水平的表达。Western收集蛋白样品（Protein sample 可以使用适当的裂解液RIPAPMS（30l10PMSF30420,000 g（15,000）15Bradford电泳SDSSDS蛋白上样缓冲液2X小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。5XSDSSDS染蛋白质分子量标准。【marker？】80-100V，120VSDSSDSV，901203.转膜（Transfer）

2、WesternPVDF3.转膜（Transfer）WesternPVDF（NC）也可以使Bio-Rad300-400mA，30-6015-20mA1-2SDS.封闭（Blocking）【western 1-2湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。用微型台式真空泵吸尽洗涤液，加Western604 封闭过夜一抗孵育（Primary antibody Western4 摇床上缓慢摇动孵育一小时4缓慢摇Western5-105-103如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。二抗孵育（Secondary antibody 参考二抗的说明书按照适当比例用 Western 二抗稀释液稀释辣

3、根过氧化物 用微型台式真空泵吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或 4在侧摆 回收二抗。加入 Western 洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤 5-10 分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤 5-10 分钟。共洗涤 3 次。如果结果背景较蛋白检测（Detection of 参考相关说明书，使用BeyoECL, Western 荧光检测试剂等ECL类试剂来检膜的重复利用（Membrane 如果蛋白样品非常宝贵，可以使用 Western 一抗二抗去除液处理蛋白膜，以Western移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡3mm（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡3

4、mm（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在凝胶面向阴极。2.371PBS-Tween。2（4过夜）300mlPBS-Tween475mlIgG（4010/100 NGS）19加入抗生素蛋白-HRP（4010/100NGS），western blotwesternblotwestern blot。实验中取胶和膜需带手套。众所周知，要用 Western Blot 比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白是指由管家基因编码表达的蛋白（HousekeepingProteins），它们在各组织和WesternBlotting-Actin（抗体）Western Blotting分子量：42Kda，IgG100

5、g/0.2ml 0.2ml/480.000.2ml/480.00在国外发表的文章中，WesternBlotting一种惯例。但是，国内仍有不少科研人员在 Western Blotting 实验中忽略了内在操作误差。在 Western blotting 实验时使用内参，即可简便地对定量和上样Western Blot SouthernNorthernWestern Blot1、SDS醇 0.2ml；ddH2O 2.8ml。1000mlddH2O1000ml50.2g；50.2g；80ml；2ml；ddH2O118ml。包被液（5%脱脂奶粉，现配）：1.0g20ml0.01M PBS0.5-1min4， 13,000g15min。取上清液作为样品。（二）SDS（三）转移：（半干式转移1、电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min32NC10min3、转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24NC241mA/cm250s50%甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用（四）10.01M PBS，5min 322hr30.01M PBS，5min34（0.01MPBS412hr1%B