蛋白质分子量的测定

1、成绩:批改日期：2015年11月20日南京林业大学实验报告专业学号姓名日期实验四蛋白质分子量的测定SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳法一、实验原理聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是根据被分离物质所带的电荷多少及其分子大 小、形状的不同，在电场的作用下，产生不同的移动速度而分离的方法。它具有 电泳和分子筛的双重作用。2.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS），是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS （十二烷基硫酸钠）。3.SDS是阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取 消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。（空间构象破坏）蛋白质与SDS分子按比例（1.4gSDS/g蛋白质）结合，形成带负电

2、荷的SDS-蛋白 质复合物，其负电荷远远超过了蛋白质分子原有的电荷，因而降低或消除了各种 蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的， 因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关 系，符合下式：logMW二K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数。若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲 线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上 求得分子量。二、凝胶的原理聚丙烯酰胺（Acr）单体和交联剂N，N -亚甲基双丙烯

3、酰胺（Bis在催化 剂的作用下聚合成含有酰胺基侧链的脂肪族长链。相邻的两个链通过亚甲基桥交 联起来就形成三维网状结构的聚丙烯酰胺凝胶。双丙烯酸铵决定交联形成的程度，丙烯酰胺决定决定交联的长度常用的催化剂（包括催化剂和加速剂）（1）过硫酸铵（AP） - TEMED （四甲基乙二胺）系统在Acr和Bis的溶液中放入这个催化系统后，过硫酸铵:（NH4） 2S2O8 产 生出游离氧原子使单体成为具有游离基的状态，从而发生聚合作用。聚合的初速 度和过硫酸铵浓度的平方根成正比。这种催化系统需要在碱性条件下进行（pH8.8）。（2）核黄素-TEMED系统这是一个光激发的催化反应。核黄素在光照下分解，被还原成

4、无色型，但在有 氧条件下，无色型又被氧化成有游离基的黄素环，使聚合作用开始。凝胶的浓度：常用的所谓标准胶是指浓度为7.5 %的凝胶，大多数生物体内的蛋白质在此 胶中电泳都能得到满意的结果。当分析一个未知样品时，常常先用7.5 %的 标准凝胶或用4%10%的凝胶梯度来试测，选出适宜的凝胶浓度。5.SDS电泳系统有两种：连续聚丙烯酰胺电泳系统：凝胶全部有分离胶组成，不具备浓缩效应。不连续的聚丙烯酰胺电泳系统：由浓缩胶和分离胶组成。通过浓缩效应、电荷效应和分子筛效应，使蛋白质在进入分离胶之前，快、 慢离子之间浓缩成一薄层，有利于提高电泳的分辨率。三、实验试剂：: Acr (acrylamide) /

5、Bis 储备液: 10% (w/v) SDS :TEMED(四甲基乙二胺)过硫酸铵(AP):10%现配现用Tris-HCL缓冲系统，分离胶缓冲液(1.5 mol/L Tris-HCl, pH 8.8)浓缩胶缓冲液(0.5 mol/L Tris-HCl, pH 6.8电极泳缓冲液：使用的Tris-甘氨酸缓冲系统：pH 8.3内含SDS样品缓冲液(62.5 mmol/L Tris-HCl, pH 6.8 )染色液(考马斯亮蓝R-250)脱色液：(甲醇：冰醋酸：水=4： 1： 5)漠粉兰：0.1%四、实验步骤：贮液配制：应汪意：配好的贮液用棕色瓶盛装置冰箱内保存，可放l2个月。过硫酸铵应当天配制。如

6、有不溶物要过滤。显色液用前再混和。电极缓冲液用时稀释10倍。安装夹心式垂直板电泳槽配胶：采用不连续系统1)分离胶的制备(10ml，12%)：蒸馏水3.4mlAcr/Bis储备液4.0ml分离胶缓冲液2.5ml10%SDS100. l10%APS50p lTEMED5. l按上述配方依次加入各种溶液，充分摇匀后灌入制胶架中。（2）浓缩胶的制备（5ml，5%）蒸馏水2.85mlAcr/Bis储备液0.85ml浓缩胶缓冲液1.25ml10% SDS50. l10% APS25. lTEMED5. l在灌入浓缩胶后插入样品梳。样品的处理及点样：将提取的蛋白质（或标准蛋白）中加入等体积的上样缓冲液，混匀

7、，置于沸水浴 中加热5min，冷却后经10000rpm离心15min，取上清液点样。电泳：将制好胶的电泳槽放入底座中，加入电极缓冲液，上层液中加入漠粉兰指示剂， 连接好电泳仪，开始电泳。浓缩胶恒压75V，分离胶恒压120V，电泳时间约90min。染色和脱色：:当蓝色染料迁移至距离橡胶框下缘1 cm时，电泳结束。:将胶剥离，放入容器中，用蒸馏水清洗2-3遍，倒入染色液染色2-3h或 静置过夜。染色结束后，用蒸馏水冲洗胶2-3遍，以清除多余的染料，倒入脱色液，置于脱 色摇床上脱色，中间换1-2次脱色液，直至背景色完全脱掉。附：样品的制备称取植物材料1g，放入研钵内，加pH8.0提取液1mL，于冷水

8、浴中 研成匀浆，然后以2 mL提取液分几次洗入离心管，在高速离心机上以 8000 rpm 离心 10miny：汪意事项:制备凝胶应选用高纯度的试剂，否则会影响凝胶聚合与电泳效果。五、实验结果logMV=K-bX蛋白质分子量迁移距离蛋白质分子量对数迁移率200KD3.30cm5.301030.62105KD4.18cm5.0211890.7979KD4.49cm4.8976270.8551KD4.71cm4.707570.8931KD4.9cm4.4913620.9215KD5.02cm4.1760910.952KD5.3cm3.301031.00系列1线性（系列1）0.20.40.60.8系列1线性（系列1）0.20.40.