实验9 具体步骤结果课件

1、综合性实验 具体安排实验思路确定目标基因，目标生物DNA提取目标基因PCR扩增PCR产物纯化pUC19骨架进行重组转化大肠杆菌重组子筛选琼脂糖电泳琼脂糖电泳PCR电泳蓝白斑筛选具体安排理解实验原理（第9周）第11周 每个小组交一份实验计划第12周 DNA提取和PCR第13周 DNA纯化和重组转化第14周 PCR验证重组子选定扩增基因 每个组4个人，可以选做两个基因片段（建议每两个人做一个基因片段） 每步工作的具体负责人和主要任务 绘一个实验流程图和构建好的载体示意图实验计划要求供选择基因CG1844(G-rich,666bp)果蝇硒蛋白，功能未知/nuccore/NC_004354.4?rep

2、ort=genbank&from=11887284&to=11888240供选择基因-2CG7050(neurexin-1， 5514bp)果蝇学习记忆相关基因/nuccore/NT_033777.3?report=genbank&from=22468512&to=22486969供选择基因-3CG8864 （Cyp28a5，2900bp）乙醇代谢解毒相关/nuccore/NT_033779.5?report=genbank&from=13977302&to=13979569引物序列（红色标记为pUC19的同源序列）CG1844length200PrimerF15-acacaggaaacagc

3、tatgaccatgattacgccaaacggattgccgagtaacacPrimerR15-cacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattcgactatgtggcgccttcattcCG7050length250PrimerF25-acacaggaaacagctatgaccatgattacgccacctcgaaattgaaccgaaaaPrimerR25-cacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattcgttactgcggttgattccacaCG8864 length 237bpPrimerF35-acacaggaaacagctatgaccatgatta

4、cgccagttaacatccgcagccaactPrimerR35-cacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattcgacccacacagaggcacctac第12周 DNA提取和PCR扩增 DNA提取： 以果蝇为例课件介绍 电泳检测DNA质量和大致浓度 PCR扩增，具体操作见课件介绍原理和实验步骤。图一 果蝇基因组DNA提取电泳图Marker:15000bpPCR程序Takara公司的Premix TaqTM Hot Start Version 成分使用量Premix Taq HS25l上游引物2l下游引物2l总基因组1.5lddH2O(20l)Up to 50l循环参数3

5、2cycle94 90 sec94 30 sec57 30 sec72 45 sec72 10 min4 取5l扩增产物以1% 琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。 图二 PCR电泳检测图 M2 1 1 2 2 3 3图二 PCR电泳检测图 M2 1 1 2 2 3 3图二 PCR电泳检测图 M2 1 1 2 2 3 3第13周 DNA纯化、重组和转化1：DNA纯化，试剂盒完成，根据买回来的试剂盒来完成实验步骤2：重组，以pUC19为骨架，进行重组；购买重组酶试剂盒完成；3：转化DNA纯化1. 实验试剂 上海生工SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒2. 实验步骤DNA纯化1. 实验试剂 上海生工S

6、anPrep柱式PCR产物纯化试剂盒2. 实验步骤DNA纯化2. 实验步骤第13周 DNA纯化、重组和转化本实验的骨架是puc19载体第13周 DNA纯化、重组和转化第13周 DNA纯化、重组和转化第13周 DNA纯化、重组和转化(1 uL)(4 uL)(灭菌)(1 uL)第13周 DNA纯化、重组和转化转化建议所使用的感受态细胞效率1108cfu/g.1）冰上融化一管100 l的DH5a感受态细胞，加入5l已稀释的的反应液到感受态细胞中，轻轻混匀，冰上孵育30分钟。2）42水浴中热激90秒后快速放入冰上3分钟。3）加入500l SOC液体培养基，37复苏45-60分钟。4）9,000rpm离

7、心3分钟收集菌体，根据需要将一定量的菌体均匀的涂布在含抗生素平板（Amp. 50-100 ug/mL)上。5) 37 培养18-24h后，平板置于4 保存。第14周 重组子筛选单克隆菌落直接PCR PCR原理和步骤同第13周。电泳检测菌落PCR从平板任意挑选5个菌落，用灭菌牙签挑取菌落（不要掺杂培养基及挑取过多菌体）成分使用量Premix Taq HS10l上游引物0.8l下游引物0.8l菌落-ddH2OUp to 20l循环参数32cycle94 90 sec94 30 sec57 30 sec72 45 sec72 10 min4菌落PCR结果的琼脂糖电泳验证1.5% agarose ge

8、l: 60mL 1XTAE+0.9 g agarose+0.6 uL GoldViewMarker: Sangon DNA Marker D Cat B600336-0260PCR产物 3-8 uL+Loading buffer (6X) 1uL电泳条件 130V 约30-60 min班级结果: 下午（左）、晚上（右）晚上班的从marker开始依次为：1.2A,2.2A,3.2遗传学综合性实验要求如下，1）实验报告以综合性小论文方式提交；2）每人自己写一份，注明小组成员，同时小组成员之间论文不能完全雷同，结果图相同，文字陈述不能完全拷贝；3）论文重点突出同源重组问题，部分结果不理想试验组重点分析试验中出现的问题；论文前言最好了解一下相关资料，比如同源重组的原理以及相关基因的信