普通微生物学实验之二微生物染色技术2012课件

1、实验二微生物染色技术普通微生物学实验普通微生物学实验主讲：郑海涛一、目的和要求1、掌握细菌涂片和染色的基本技术2、了解革兰氏染色的机理、掌握革兰氏染 色的方法3、掌握细菌芽孢的染色方法4、掌握无菌操作技术5、学会使用普通生物显微镜 二、实验原理1、细菌细胞微小且无色透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须借助染色剂使菌体着色，增加与背景的反差，才能在显微镜下观察菌体的个体形态和部分结构。 因此，微生物染色是微生物学中的一项基本技术。染料能使细菌着色，并且因细菌细胞的结构和化学成分不同，而会有不同的染色反应。在一般情况下细菌菌体多带负电荷，所以常用碱性染料进行染色。碱性染料并不是碱，和其它染料一样

2、是一种盐，电离后染料离子带正电，易与带负电的细菌结合而使细菌着色。生物染色常用的碱性染料有结晶紫、美蓝、石炭酸复红、番红等。 （1）简单染色实验原理2、简单染色法：是只用一种染色剂对细胞进行染色。此法操作简便，适用于菌体的一般形态观察，但通常不能显示细胞构造，也不能鉴别细菌类别。染色前必须将菌体涂布于载玻片上并进行固定，其目的是杀死细菌，并使菌体粘附在载玻片上，防止菌体被染色剂冲掉。此外还可增加菌体对染料的亲和力。（2）革兰氏染色实验原理 3、革兰氏染色法(Gram stdn)是丹麦医生Gram于1884年创立的。通过这一染色，可把几乎所有细菌分成革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌(简写为G+、G-)

3、两大类。因此它是细菌分类鉴定时的重要指标。又由于这两大类细菌在细胞结构、成分、生理、生化、遗传、免疫、生态及药物敏感性方面都呈现出明显的差异，因此任何细菌只要先通过简单的革兰氏染色，即可提供不少其它重要的生物学特征方面的信息。 （3）芽孢染色原理 4、芽孢壁比营养细胞的细胞壁结构复杂而且致密，透性低，着色和脱色较营养细胞难。采用碱性染料并在微火上加热，或延长染色时间，使菌体和芽孢同时染色后，用蒸馏水冲洗，脱去菌体颜色，保留芽孢的颜色。并用另一种对比鲜明的染料使菌体着色。三、实验材料及仪器 (一)菌种 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 大肠埃希氏菌(Escherichia co

4、li) 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(二)试剂 革兰氏染色液、（草酸铵结晶紫染色液、路哥氏碘液、95乙醇、番红染色液）、孔雀石绿染液。(三)其它 显微镜，载玻片，接种环，酒精灯，香柏油，二甲苯，擦镜纸等。(二)染色1、革兰氏染色(1)初染：在涂片菌膜处滴加草酸铵结晶紫染液，染色约11.5min，然后用细小的水流从标本上端冲净残余染液(注意勿使水流直接冲洗涂菌处)，至流下的水无色为止。(2)媒染：滴加路哥氏碘液覆盖菌膜，媒染约11.5min，然后用流水冲洗掉多余的碘液。用吸水纸吸干载片上的水分。(3)脱色：倾斜玻片并衬以白色背景，流滴95乙醇冲洗涂片，同时轻轻摇动

5、载片使乙醇分布均匀，至流出的乙醇刚刚不出现紫色时即停止脱色(或静止30-40秒)，并立即用水冲净乙醇。 (4)复染：滴加番红染液，染色3min，水洗后用滤纸吸干水分。(5)待干燥后油镜观察革兰氏染色法1.涂片固定2.单染结晶紫染液第一次染色 1-1.5min 3.媒染碘-碘化钾溶液浸湿1min4. 脱色95%乙醇溶液进行颜色洗脱30-40S5.复染番红染液第二次染色1.5min2、芽孢染色(1)用培养24h左右的斜面菌种作涂片、干燥、固定、加滤纸(2)滴加35滴孔雀石绿染液于固定好的涂片上至滤纸饱和。(3)用试管夹夹住载玻片，在火焰上方徐徐加热，保持染液冒蒸汽而不沸腾，切勿使染液蒸干，必要时应

6、添加少许染液。从染液蒸汽开始计时，加热45min。 (4)倾去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再退色为止(5)用番红水溶液复染3min，水洗。 (6)待干燥后，置油镜下观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色芽孢染色（二）、光学生物显微镜的使用一、目的和要求 由于微生物的个体小，必须借助于显微镜将其放大才能看清楚它们的形态，所以显微镜的使用是微生物学的基本操作，必须认真掌握。1了解普通生物显微镜的构造和性能 2正确掌握显微镜的使用技术和保养方法二、实验材料及仪器 (一)标本片 自己制作的细菌涂片(二)仪器和药品 普通光学生物显微镜、镜头纸、香柏油、二甲苯等三、实验内容 显微镜的构造 普通光学生物显微镜由机械系统和光学系统组成。 接目镜镜筒物镜转换器接物镜载物台聚光器镜臂粗调螺旋细调螺旋镜座光源电源开关光源调节器玻片推进器虑光片虹彩光圈四、显微镜的保养 显微镜是精密贵重的仪器，须很好地保养。使用时应注意下列事项。(1)显微镜不能随便拆卸，各透镜应用镜头纸擦拭不得以手沾抹或用其它纸、布等擦拭，以免破坏镜头，沾上手印。(2)勿将显微镜与酸、碱及挥发性药品放在一起。 (3)避免阳光暴晒，以免在高温下柏胶溶解或变形，使透镜脱落。 (4)显微镜应存放在干燥地点，雨季应在箱内放置硅胶以吸收水分。五、作业1、按照显微镜的使用方法，观察自己制作的细菌染色涂片。2、