免疫细胞化学步骤及说明

1、1. 细胞爬片制备盖玻片在75%酒精浸泡24h以上，超净台内酒精灯上烤干。六孔板内分别滴入一滴培养液，盖上盖玻片。分别加入等量细胞，常规培养至细胞70%左右融合。关于盖玻片的准备，有很多种说法，但我的做法比较简单，这样做不会脱片，也不影响观察。2. 细胞固定6孔板置冰上冷却，吸尽培养液。4PBS，洗5min3次。吸去残留PBS，空气干燥，细胞面微潮湿时，加入预冷95%酒精固定液，浸没细胞面，更换预冷95%酒精2次，第三次在-20静置20min。这一步用4%多聚甲醛可能更省时省事。3. SP法免疫组化染色步骤(1)细胞爬片蒸馏水洗5min1次，PBS浸泡5min。固定之后的细胞一般不会脱落，可以

2、放在摇床上洗。(2)滴加3%H2O2去离子水，室温孵育30min。PBS洗5min3次。(3)滴加0.3%Triton X-100（全液用蒸馏水稀释）通透30min。PBS洗5min3次。细胞通透很重要，因为蛋白在胞内，我第一次做时没有通透，结果什么都没有。(4)BSA封闭，室温10min。倾去，勿洗。(5)滴加一抗(a-actin l:300)，4过夜。PBS洗5min3次。抗体的浓度是自己摸索出来的，还有听说4过夜是比较合适的做法。(6)滴加二抗(聚合HRP标记抗小鼠IgG)，室温30min。PBS洗5min3次。(7)按1mL蒸馏水+A、B、C（DAB试剂盒，要按顺序滴加）各一滴，混匀，

3、镜下显色观察，注意避光。蒸馏水充分冲洗。(8)苏木素染2min。自来水充分冲洗。(9)依次在75%85%95%100%浓度酒精中浸泡2min脱水。封片之前常规有二甲苯透明的，但我滴加了二甲苯之后，片子变得很脏，不知什么原因。后来就不加了，直接脱水后封片，现在看来片子还不错啊。而且二甲苯太呛人了。(10)中性树胶封片。免疫细胞化学步骤：固定液配方（细胞免疫组化，用的是4%多聚甲醛固定的）：我们用的4%多聚甲醛是先配制成12.5%的，然后再用0.1m PB稀释的。0.1m PB配方（PH值7.4）1000ml磷酸氢二钠 48.693g磷酸二氢钠 5.023g三蒸水 1000ml12.5%多聚甲醛（

4、PH值7.4）1000ml多聚甲醛 125g三蒸水 1000ml 磁力搅拌器加热搅拌，温度控制在60以下，如仍不溶，加NaOH（三蒸水先放800ml，10小时左右，再补加200ml）4%多聚甲醛（PH值7.4）1000ml12.5%多聚甲醛 320ml0.1m PB 680ml步骤：1 将已消毒的20mm盖玻片置于90mm培养皿中，按2*104/ml的细胞密度将细胞接种于培养皿中进行细胞爬片，5天后进行免疫细胞组织化学染色鉴定。2 PBS清洗标本 3次 各 1 min。3 冰丙酮固定 15 min。4 空气干燥 5min。5 PBS清洗标本 3次 各 2 min。6 0.5%Triton X-

5、100( DPBS配 ) 孵育 1次 20 min。7 PBS清洗标本 3次 各 2 min。8 3%H2O2孵育 15 min。9 DPBS清洗标本 3次 各 2 min。10 封闭血清孵育（5%正常二抗血清DPBS液） 20min。11 一抗孵育（PBS配，滴度1：200，湿盒）4OC 过夜或37OC 60 min。阴性对照最好用一抗来源血清，否则用PBS液12 PBS清洗标本 3次 各 5 min。13 二抗工作液孵育（湿盒） 37OC 30 min。14 PBS清洗标本 3次 各 5 min。15 C液（湿盒） 37OC 30 min。16、PBS清洗标本 3次 各 5 min。17、

6、DAB显色（避光，镜下观察至棕色 ） 约310min。18、蒸馏水洗 2次 1 min。19、苏木素复染 0.51min。20、自来水洗 30min。21、树胶封片。1、良好的细胞爬片是进行免疫组织细胞的基础，要获得良好细胞爬片须注意以下：（1） 对于粘附分子较少的细胞爬片时间要达5天以上，这样细胞爬片才较牢固，冲洗时不易脱片；（2） 接种的细胞密度适中，以2*104/ml为宜，若细胞密度太高，5天后细胞连接成片冲洗时易脱片；2、冰丙酮固定后玻片可密闭保存于4OC冰箱，冰丙酮固定时会使细胞收缩，可用80%冰丙酮或2%多聚甲醛固定。3、冲洗时只须轻轻振荡培养皿，（不可用吸管太用力吹，易脱片）4、加一抗、二抗后冲洗时第一次