重组蛋白和多肽的分离纯化

1、重组蛋白和多肽的分离纯化1. 概述分离纯化组成了基因工程的下游处理（downstream processing） 阶段，这一过程又和上游过程紧密相联系，上游过程的诸方面影响到下游的分离纯化，所以在进行目标蛋白质表达纯化时要统一考虑和整体设计，并充分考虑上游因 素对下游的影响，如是否带有亲和标签，是否进行分泌表达。目前应用最广泛的表达系统有三大类，分别是大肠杆菌表达系统、 HYPERLINK /Search.asp?Field=Title&ClassID=&keyword=%E9%85%B5%E6%AF%8D 酵母表达系统和CHO细 胞表达系统，不同的表达系统和培养方法显著影响下游的处理过程，目

2、标蛋白表达是否形成包涵体，目标蛋白表达的定位（胞内、细胞内膜、周质空间和胞外），蛋 白表达的量都依赖于所选择的表达系统。选择将所表达的蛋白分泌到细胞外或周质空间可以避免破碎细胞的步骤，并且由于蛋白质种类少，目标蛋白容易纯化；而在 细胞质内表达蛋白，可能是可溶性表达，可能形成包涵体，可溶性的蛋白往往需要复杂的纯化步骤，而包涵体易于分离，纯度较高，但回收具有生物活性的蛋白却变 的相当困难，需要对聚集的蛋白进行变复性，通常活性蛋白的得率比较低，表1列出了不同策略对表达、纯化的影响，对于其中的有些缺点可以通过一定的方法进行克服和避免，如利用DNA重组技术给外源蛋白加上一个亲和纯化的标签，有助于可溶性外

3、源蛋白的选择性纯化，并能保护目标蛋白不被降解（96）。表 1 重重组蛋白白不同表表达策略略的优点点和缺点点表达策略优点缺点分泌表达至至细胞外外增强正确二二硫键的的形成降低蛋白酶酶对表达达蛋白的的降解可获得确定定的N末端显著减少杂杂蛋白水水平，简简化纯化化不需要细胞胞破碎表达水平低低多数蛋白不不能进行行分泌表表达表达蛋白需需要进行行浓缩细胞周质空空间表达达增强正确二二硫键的的形成可获得确定定的N末端显著减少杂杂蛋白水水平，简简化纯化化好些蛋白不不能分泌泌进入周周质空间间没有大规模模选择性性的释放放周质空空间蛋白白的技术术周质蛋白酶酶可引起起重组蛋蛋白酶解解胞内包涵体体表达包涵体易于于分离保护蛋白

4、质质不被降降解蛋白质不具具有活性性对宿主主细胞生生长没有有大的影影响，通通常可获获得高的的表达水水平需要体外的的折叠和和溶解，得得率较低低具有不确定定N末端胞内可溶性性蛋白表表达不需要体外外溶解和和折叠一般具有正正确的结结构和功功能高水平的表表达常难难以得到到需要复杂的的纯化可发生蛋白白质的酶酶解具有不确定定的N末端在 细胞的的提取物物中，除除了目标标蛋白外外，还含含有其它它各种性性质的蛋蛋白、核核酸、多多糖等。在在这样一一个混合合体系中中，蛋白白质纯化化要求将将目标蛋蛋白与其其它的成成分分离离，得到到一定 的量，达达到一定定的纯度度，同时时要尽可可能保留留蛋白的的生物活活性，并并使蛋白白保持

5、完完整。所所以蛋白白质的分分离纯化化可以看看作是一一系列的的分部收收集过程程，总是是希望目目标蛋白白富集 于其中中的一个个收集部部位，而而大量的的杂蛋白白存在于于其它的的收集部部位。当当然对目目标蛋白白纯度的的要求要要根据纯纯化蛋白白的用途途而定，对对于治疗疗性的蛋蛋白要求求有大于于99%的纯度度，并对对处方有有活性和和稳定性性的要求求，对于于某些酶酶的纯度度则要求求较低，需需要在纯纯度和得得率之间间进行一一个平衡衡，所以以下游的的工艺流流程取决决于最终终对目标标蛋白的的要求。蛋 白质的的功能依依赖于蛋蛋白质的的结构，对对于有生生物活性性的蛋白白质，在在分离纯纯化过程程中必须须根据目目标蛋白白

6、的特点点，采用用合适的的操作条条件和方方法，保保证目标标蛋白的的活性尽尽量不 损失。除除了在分分离纯化化的初期期，要采采用快速速的方法法除去影影响目标标蛋白稳稳定性的的杂质，还还要严格格控制涉涉及蛋白白质变性性的各种种因素，来来避免蛋蛋白质失失去活性性。蛋白白质的构构 象稳定定性可以以通过测测定蛋白白质变性性反应时时折叠（f）和去折叠（u）间自由能的变化（Gfu）来衡量，Gfu越大蛋白质就越稳定。根据报导蛋白质的Gfu在520kcal/mol范围之间，单个氢键可造成0.52kcal/mol自由能的变化，一个离子对可造成0.41.0kcal/mol自由能的变化，因此Gfu相对比较小，这样天然状态

7、仅仅比去折叠状态稳定一点，所以必须克服蛋白质内在的不稳定性，保留蛋白的活性。这一点在分离纯化和蛋白质储存中都很重要，影响蛋白质稳定性的因素有温度、pH、离子强度、某些添加剂、表面吸附、震摇、剪切力、冻融、蛋白浓度、压力等，这些因素对折叠的影响有的是可逆的，有的是不可逆的，而且相互之间也有影响，在实际处理中应选择合适的条件，尽量避免不利因素的影响（2），并利用活性跟踪的方法对处理进行评价，指导分离纯化。在 进行任任何纯化化工作时时，第一一步必须须针对目目标蛋白白建立特特异性的的分析方方法。这这些特异异性的分分析方法法都是基基于目标标蛋白的的一些特特性，如如酶的活活性，免免疫学活活性，物物理特性性

8、 （如分分子量、等等电点、光光谱学特特征等），生生物学活活性。在在理想的的情况下下，我们们希望所所选择的的分析方方法具有有特异、快快速、灵灵敏和可可定量的的特点。特特异性要要求分析析方法反反 映目标标蛋白的的独特性性，以排排除假阳阳性。快快速则要要求能很很快的给给出定性性和定量量结果，以以便更好好的与分分离纯化化的工作作相衔接接。灵敏敏的分析析方法仅仅需要少少量的样样品，这这就给 操作带带来了极极大的方方便。在在分离纯纯化的每每一步，都都需要对对蛋白和和活性进进行定量量，这就就要求分分析方法法有准确确可定量量的特点点，以对对分离纯纯化的效效果进行行评价。如如通过SSDS-PAGGE电泳泳测定蛋

9、蛋白质分分子量来来鉴定蛋蛋白质，由由于电泳泳的分辨辨率限制制，常常常不能确确定收集集部位中中是否含含有目标标蛋白或或目标蛋蛋白是否否得到了了富集，这这时就需需要运用用更特异异的分析析方法，如如Wessterrn bblotttinng就 可以从从复杂的的混合物物中描述述蛋白的的分子量量，并对对蛋白进进行定量量。另外外当一些些蛋白没没有方便便可用的的生物学学活性测测定方法法，或者者由于干干扰物质质的存在在不能测测活，可可应用一一 些免疫疫学的方方法进行行检测。在在纯化的的过程中中，需要要监测以以下几个个参数：总的样样品体积积，样品品中总的的蛋白，目目标蛋白白的活性性单位，通通过这些些基本的的信息

10、，就就可以跟跟踪每 步纯化化的效率率，计算算出目标标蛋白的的回收率率，目标标蛋白的的比活性性，以及及纯化的的倍数，从从而对纯纯化的每每一步，乃乃至整个个流程进进行定量量评价。Richard等在纯化重组大肠杆菌RNA聚合酶32亚基的工作中给出了很好的范例，在定量测定项中，包括了蛋白质的定量测定、定量SDS、定量蛋白质斑点印迹和酶活测定，使用这些方法对操作的每一个阶段取样进行纯化效果的评价，从而确保每一步纯化的有效性（1）。正是由于分析方法在分离纯化中的指导性作用，所以有效的分析方法是分离纯化是否能够成功的前提。1. 分离离纯化的的方法策策略及其其应用下 游的分分离纯化化步骤不不仅要在在可替换换的

11、分离离技术间间进行选选择，如如细胞的的破碎可可选择高高压匀浆浆法、高高速珠磨磨法、超超声破碎碎或酶溶溶法，分分离细胞胞、细胞胞碎片、包包涵体和和沉淀 物，可可选择离离心或过过滤，需需要进行行浓缩的的时候，可可选择沉沉淀或超超滤；另另一方面面，设计计的纯化化工艺包包括特定定的层析析步骤，及及层析的的先后顺顺序，以以期得到到最大的的得率。吸吸 附层析析，如离离子交换换层析，疏疏水层析析和亲和和层析，可可基于特特定的选选择性达达到对目目标蛋白白的纯化化，适用用于大量量样品的的处理。凝凝胶过滤滤层析用用于后续续的精制制步骤，如如去除 少量的的杂蛋白白或聚合合体，在在纯化过过程中用用于脱盐盐和缓冲冲液交

12、换换。在分分离纯化化中对每每个步骤骤的选择择，可以以遵循以以下原则则：1 应尽可可能的利利用蛋白白质的不不同物理理特性选选择所用用的分离离纯化技技术，而而不是利利用相同同的技术术进行多多次纯化化；2不 同的蛋蛋白质在在性质上上有很大大的不同同，这是是能从复复杂的混混合物中中纯化出出目标蛋蛋白的依依据，每每一步纯纯化步骤骤应当充充分利用用目标蛋蛋白和杂杂质成分分物理性性质的差差异。所所以在分分 离纯化化的开始始阶段，要要尽可能能的了解解目标蛋蛋白的特特性，不不仅如此此还要了了解所存存在杂质质成分的的性质，如如大肠杆杆菌的蛋蛋白大多多是一些些低分子子量的蛋蛋白（500000DDa），而而且酸性性蛋

13、白较较多；33 在纯纯化的早早期阶段段要尽量量减少处处理的体体积，方方便后续续的纯化化；4 在纯化化的后期期阶段，再再使用造造价高的的纯化方方法，这这是因为为处理的的量和杂杂质的量量都已减减少，有有利于昂昂贵纯化化材料的的重复使使用，减减少再生生的复杂杂性（884）。在下游的纯纯化工艺艺中为了了提高蛋蛋白的得得率和处处理的效效率，应应当使用用最少的的纯化步步骤，经经典的纯纯化过程程如图11 所示示。在初初始的纯纯化阶段段，除了了使目标标蛋白和和细胞内内的DNNA、RNAA、 多糖以以及性质质差别较较大的蛋蛋白质成成分分离离，采用用的分离离方法要要能除去去影响目目标蛋白白稳定性性的杂质质，保护护

14、目标蛋蛋白不被被蛋白酶酶降解，进进行目标标蛋白的的捕获和和浓缩。在在这 一阶段段的纯化化中，盐盐析沉淀淀仍然应应用，但但共沉淀淀的杂质质常常很很多，离离子交换换层析和和疏水层层析具有有操作上上的优点点，可以以再生使使用，成成为这一一步通常常选用的的层析方方法；中中 间阶段段纯化是是最为关关键的阶阶段，这这时要能能达到和和大量的的杂蛋白白分离，利利用蛋白白质不同同的性质质选择不不同的纯纯化方法法，每一一步的方方法要有有足够的的选择性性，提高高目标蛋蛋白质 的纯度度；最后后进行精精制纯化化，常用用凝胶层层析，使使目标蛋蛋白的纯纯度进一一步提高高达到要要求。对对于包涵涵体蛋白白质，由由于涉及及包涵体

15、体蛋白质质的变复复性，其其纯化步步骤和方方法与可可 溶性蛋蛋白不同同，需要要对每一一种包涵涵体蛋白白质建立立相应的的复性方方法，将将在后面面作介绍绍。图1 经典典的蛋白白质纯化化流程图图在工业上，为为了尽可可能提高高过程的的通量和和减少生生产的成成本，发发展的方方法与传传统的方方法不同同。双水水相萃取取和扩张张床吸附附技术，可可以处理理全 HYPERLINK /Search.asp?Field=Title&ClassID=&keyword=%E7%BB%86%E8%83%9E%E5%9F%B9%E5%85%BB 细胞胞培养液液，通过过整合技技术的使使用，能能达到萃萃取、浓浓缩和初初步纯化化的目

16、的的。另外外这两种种技术和和亲和相相互作用用结合可可进一步步提高处处理的选选择性。相相似的，亲亲和相互互作用还还可以整整合进其其它的高高通量处处理，如如亲和膜膜过滤和和亲和沉沉淀（22）。生生产上使使用的非非线性色色谱，如如置换色色谱，一一次层析析的载量量很大，得得到的蛋蛋白纯度度很高，近近年来也也有很大大的发展展和应用用（855,366）。2.1 包包涵体蛋蛋白质的的折叠复复性在过去几十十年的发发展过程程中，重重组DNNA技术术为大规规模生产产目标蛋蛋白提供供了新的的途径，尽尽管有不不同的宿宿主系统统可供选选择，如如果翻译译后修饰饰不是蛋蛋白质功功能所必必需的话话，大肠肠杆菌和和其它的的原核

17、宿宿主系统统仍然是是生产重重组蛋白白的首选选(177)。细细菌如大大肠杆菌菌可以在在短时间间里得到到高水平平表达的的蛋白质质，但同同时表达达的蛋白白质常常常形成非非活性的的包涵体体。包涵涵体的形形成是一一个由许许多蛋白白质参与与的极端端复杂的的动力学学过程，依依赖于蛋蛋白质的的折叠速速率和聚聚集速率率，并且且与蛋白白质的合合成和降降解程度度相关（35）。 强的表达系统，高的诱导剂浓度，相对较高的培养温度常常造成包涵体的形成。除了外界因素，包涵体的形成依赖于蛋白质特异的折叠行为，而不是蛋白的通常特 性，如大小，融合标签，相对的疏水性。尽管如此，限制折叠速率的结构特性，如二硫键的形成常常是含有二硫

18、键蛋白质正确折叠的限速步骤（并不绝对，因为有些 蛋白质二硫键的破坏并不影响其功能），富含二硫键的蛋白质具有更为复杂的结构，当高水平表达时，由于大肠杆菌细胞质是一个偏还原性的环境，蛋白质容易形成 错配的二硫键，这常常是包涵体形成的主要原因。膜蛋白具有暴露的疏水区，表达时易于聚集形成包涵体，也有可能由于降解或对细胞的毒性作用使得表达水平极低 （45）。蛋白质的糖基化可以影响到蛋白质的折叠行为和溶解性，当它们在原核系统进行表达时，也容易聚集（4）。蛋白质进行行可溶性性表达和和表达形形成包涵涵体各有有利弊，对对许多蛋蛋白，再再折叠很很困难，或或者不可可能，进进行可溶溶性的表表达就是是首选。现现在发展展

19、了许多多方法减减少包涵涵体的形形成，如如使用中中等强度度或弱的的启动子子，低温温培养，有有限的诱诱导，优优化培养养基条件件，进行行融合表表达(449)，与与伴侣分分子和折折叠酶共共表达(3,55)，表表达定位位于不同同的空间间(7,58)，选择择突变的的菌株（6,43）或其他的原核表达系统(34)。由于影响蛋白质细胞合成和折叠的因素太多，优化结果不可预测，如对于 HYPERLINK /antibody/ 抗体Fab片段，尽管只有可变区序列不同，也不能预测新的Fab片段在体内是否可以正确折叠（4），所以即使采用了促进可溶性表达的方法，也不能保证不形成包涵体。从 另一方方面来讲讲形成的的包涵体体易

20、于和和细胞的的其它成成分分离离，而且且过量表表达的目目标蛋白白在包涵涵体中得得到了富富集，提提高了纯纯度，降降低了分分离纯化化的难度度。所以以如果包包涵体蛋蛋 白可以以进行体体外的正正确折叠叠，那么么形成包包涵体就就可以接接受，对对易受细细菌蛋白白酶降解解的蛋白白质或对对细菌有有毒性的的蛋白质质来说，表表达产生生包涵体体是绝对对必要的的。内皮皮抑素 （enddosttatiin）可可以特异异性的抑抑制内皮皮细胞的的增殖，具具有抑制制新生血血管生成成和抑制制肿瘤生生长的作作用，已已进入临临床研究究阶段。采采用 HYPERLINK /Search.asp?Field=Title&ClassID=&

21、keyword=%E9%85%B5%E6%AF%8D 酵母母表 达系统统，可直直接产生生具有活活性的蛋蛋白质，但但是表达达的水平平和蛋白白质的回回收率较较低，采采用大肠肠杆菌表表达则形形成包涵涵体，包包涵体蛋蛋白质的的折叠复复性非常常困难，改改善蛋白白质 的折叠叠复性具具有实际际的应用用意义。通通过对内内皮抑素素折叠机机制的研研究表明明，紧密密折叠的的内皮抑抑素对酸酸耐受，在在酸性条条件下有有可能得得到大量量的正确确折叠的的蛋白质质（155）。所所以如果果对于包包涵体蛋蛋白质，通通过机制制的研究究，能够够解决折折叠复性性的问题题，那么么利用包包涵体的的高水平平表达，就就可以得得到大量量的蛋白白

22、质，降降低生产产的成本本。在包涵体蛋蛋白质的的变复性性中，不不管是采采用什么么方法进进行折叠叠，都要要用变性性剂溶解解包涵体体，最终终又都要要去除变变性剂，理理解变性性剂对蛋蛋白质的的影响可可以指导导我们设设计复性性过程。 图2：在各各种变性性剂浓度度条件下下蛋白质质的溶解解性和构构象。如图2所示示，随着着变性剂剂浓度的的变化，不不仅具有有天然构构象状态态蛋白质质的比率率在改变变，而且且蛋白质质的溶解解性也在在改变。在在高的变变性剂浓浓度条件件下，蛋蛋白质的的极性和和非极性性侧链都都是可溶溶的，但但是蛋白白质却是是去折叠叠的，如如图2中d所标的的区段。在在低的变变性剂浓浓度条件件下，如如图2中

23、a区段所所示，天天然构象象的蛋白白质是稳稳定的，但但也会稳稳定部分分折叠的的中间体体，这些些部分折折叠的 HYPERLINK /industry/Special/middle/Index.shtml 中中间体易易于自我我缔合形形成沉淀淀。所以以选择bb区段所所在的变变性剂浓浓度来进进行蛋白白质的折折叠更为为有效，这这一区段段即可以以稳定蛋蛋白质的的天然构构象，而而且可以以增加天天然构象象蛋白质质的溶解解性，对对于部分分折叠的的 HYPERLINK /industry/Special/middle/Index.shtml 中间体体却没有有稳定作作用。避避免选择择c区段所所在的条条件进行行折叠，因

24、因为这一一区段天天然和变变性的蛋蛋白质都都只有有有限的溶溶解性，折折叠速度度也很慢慢（133）。这这一图示示所展示示的规律律对所有有蛋白并并不是统统一的，但但它向我我们描述述了一个个大概的的情况，在在这一过过程，不不仅仅要要考虑变变性剂对对天然构构象和折折叠 HYPERLINK /industry/Special/middle/Index.shtml 中间间体的稳稳定作用用，还要要考虑对对蛋白溶溶解性的的影响。在在高的变变性剂浓浓度，蛋蛋白质是是去折叠叠的，充充分溶剂剂化的，柔柔性的，在在折叠缓缓冲溶液液中，蛋蛋白质是是折叠的的，具有有刚性的的，将蛋蛋白质从从高变性性剂浓度度条件变变为折叠叠缓

25、冲溶溶液，就就会使蛋蛋白质坍坍塌形成成紧凑的的结构，但但蛋白的的这一过过程不总总能有效效进行，常常常存在在错误折折叠和聚聚集，所所以在包包涵体的的变复性性过程中中，除了了要控制制上面所所讲的参参数，还还有两方方面的参参数需要要控制，一一是应用用添加剂剂，来促促进折叠叠、减少少聚集，二二是控制制溶液的的氧化还还原状态态促进二二硫键的的正确配配对。通常从包涵涵体中回回收活性性蛋白质质包括三三个步骤骤：包涵涵体的分分离和洗洗涤，包包涵体蛋蛋白质的的溶解和和溶解蛋蛋白质的的再折叠叠。前两两个步骤骤效率较较高，但但是再折折叠的效效率率常常常不能能令人满满意，折折叠的方方法和折折叠的条条件需要要通过实实验

26、来进进行筛选选。2.1.11 蛋白白质折叠叠的过程程和机理理对蛋白质折折叠机理理的研究究，对保保留蛋白白质活性性，维持持蛋白质质稳定性性和包涵涵体蛋白白质折叠叠复性都都具有重重要的意意义(221)。早早在上世世纪300年代，我我国生化化界先驱驱吴宪教教授就对对蛋白质质的变性性作用进进行了阐阐释（88），300年后，AAnfiinseen通过过对核糖糖核酸酶酶A的经典典研究表表明去折折叠的蛋蛋白质在在体外可可以自发发的进行行再折叠叠，仅仅仅是序列列本身已已经包括括了蛋白白质正确确折叠的的所有信信息（99,100），并并提出蛋蛋白质折折叠的热热力学假假说，为为此Annfinnsenn获得19972

27、年年诺贝尔尔化学奖奖。这一一理论有有两个关关键点：1蛋白质质的状态态处于去去折叠和和天然构构象的平平衡中；2 天 然构象象的蛋白白质处于于热力学学最低的的能量状状态。尽尽管蛋白白质的氨氨基酸序序列在蛋蛋白质的的正确折折叠中起起着核心心的作用用，各种种各样的的因素，包包括信号号序列，辅辅助因子子，分子子伴 侣，环环境条件件，均会会影响蛋蛋白质的的折叠，新新生蛋白白质折叠叠并组装装成有功功能的蛋蛋白质，并并非都是是自发的的，在多多数情况况下是需需要其它它蛋白质质的帮助助，已经经鉴定了了许多参参与 蛋白质质折叠的的折叠酶酶和分子子伴侣（3,16,86）， 蛋白质“自发折叠”的经典概念发生了转变和更新

28、，但这并不与折叠的热力学假说相矛盾，而是在动力学上完善了热力学观点。在蛋白质的折叠过程中，有许多作用 力参与，包括一些构象的空间阻碍，范德华力，氢键的相互作用，疏水效应，离子相互作用，多肽和周围溶剂相互作用产生的熵驱动的折叠（12,52），但对于蛋白质获得天然结构这一复杂过程的特异性，我们还知之甚少，许多实验和理论的工作都在加深我们对折叠的认识，但是问题仍然没有解决。在折叠的机机制研究究上早期期的理论论认为，折折叠是从从变性状状态通过过中间状状态到天天然状态态的一个个逐步的的过程，并并对折叠叠中间体体进行了了深入研研究，认认为折叠叠是在热热力学驱驱动下按按单一的的途径进进行的。后后来的研研究表

29、明明折叠过过程存在在实验可可测的多多种 HYPERLINK /industry/Special/middle/Index.shtml 中间间体，折折叠通过过有限的的路径进进行。新新的理论论强调在在折叠的的初始阶阶段存在在多样性性，蛋白白质通过过许多的的途径进进入折叠叠漏斗（folding funnel），从而折叠在整体上被描述成一个漏斗样的图像，折叠的动力学过程被认为是部分折叠的蛋白质整体上的进行性装配，并且伴随有自由能和熵的变化，蛋白质最终寻找到自己的正确的折叠结构，这一理论称为能量图景（energy landscape），如图3所示，漏斗下方的凹凸反映蛋白质构象瞬间进入局部自由能最小区域(

30、13,14)。图 3：能能量图景景（Thhe eenerrgy lanndsccapee）的示示意图，高高度代表表能量尺尺度，宽宽度代表表构象尺尺度，在在漏斗（funnel）的下方存在别的低能量状态，共存的不同能量状态的蛋白质种类也降到最小(14)。这一理论认认为结构构同源的的蛋白质质可以通通过不同同的折叠叠途径形形成相似似的天然然构象，人人酸性成成纤维生生长因子子（hFFGF-1）和和蝾螈酸酸性成纤纤维生长长因子（nFGF-1）氨基酸序列具有约80%同源性，并且具有结构同源性（12个折叠反向平行排列形成折叠桶），在盐酸胍诱导去折叠的过程中，hFGF-1可以监测到具有熔球体样的折叠 HYPER

31、LINK /industry/Special/middle/Index.shtml 中间体，而nFGF-1经由两态（天然状态到变性状态）去折叠，没有检测到 HYPERLINK /industry/Special/middle/Index.shtml 中间体的存在，折叠的动力学研究也表明两种蛋白采用不同的折叠机制（38）。对于同一蛋白质，采用的渗透压调节剂（osmolytes）不同，蛋白质折叠的途径也不相同，说明不同的渗透压调节剂对蛋白质的稳定效应不同（11）。这两个例子都说明折叠机制的复杂性，也与上面所介绍的理论相吻合。 2.1.22 包涵涵体的分分离和溶溶解分 离包涵涵体的第第一步是是对细菌

32、菌进行最最大限度度的溶解解，将几几种细胞胞破碎技技术相结结合，如如联合使使用溶菌菌酶处理理，高压压匀浆细细胞破碎碎和含表表面活性性剂的高高盐溶液液处理，可可以使 膜碎片片和细胞胞壁碎片片最大限限度的分分解。细细胞破碎碎后，通通过离心心的方法法可以很很方便的的回收包包涵体，再再用洗涤涤液（通通常含有有低浓度度的变性性剂，表表面活性性剂，还还原剂，EDTA）对包涵体进行清洗，就可以得到较纯的包涵体（4，74）。通常要选用强的变性剂使蛋白质完全变性溶解，如6 M的盐酸胍和8 M 的尿素，蛋白质浓度多采用1-10mg/ml（22）。由于盐酸胍溶解包涵体蛋白质能力比尿素强，而且尿素中的异氰酸酯可以使自由

33、氨基氨甲酰化（这种作用在碱性条件下表现的更强），所以常常首选盐酸胍作为解离剂。对含有分子间二硫键或非天然二硫键的包涵体蛋白质，在溶解过程中需要加入还原剂，如二硫苏糖醇，-巯基乙醇，还原型谷胱甘肽，加入螯和剂，如EDTA，可以防止金属催化的半胱氨酸氧化。除此之外，改变pH和使用表面活性剂也被用于溶解包涵体蛋白质（22），相对而言，这两种方法的应用较少，而且只有具有正确二硫键的包涵体蛋白质才可以用表面活性剂进行溶解，否则可同时形成正确的和非正确的二硫键，表明用尿素、盐酸胍变性和用表面活性剂变性对蛋白质的结构和动力学有不同的影响，Tsumoto在这方面做了详细的论述（25）。Pandaa等在高高pH

34、 条件下下使用低低浓度的的尿素溶溶解包涵涵体蛋白白质，用用于重组组牛生长长激素、重重组人生生长激素素和猕猴猴透明带带糖蛋白白的变复复性，认认为在变变性时蛋蛋白质所所保留的的天然二二级结构构有助于于蛋白的的折叠，减减少蛋白白质的聚聚集。但但采用的的高pHH条件可可以使氨氨基酸残残基发生生化学修修饰，还还需要更更多的验验证（773）。以上变性的的方法属属于化学学变性，使使用高的的静力压压提供了了蛋白质质变性的的另外一一种物理理变性方方法，静静力压促促进蛋白白质变性性解离，是是因为蛋蛋白质在在变性条条件下，系系统整体体趋向于于更小的的体积。联联合使用用高压和和低浓度度的变性性剂已用用于包涵涵体蛋白白

35、质和蛋蛋白质聚聚集体的的变性，是是一种有有前景的的变性方方法（331,883)。2.1.33 溶解解后包涵涵体蛋白白质的折折叠复性性蛋白质分子子变性后后，通过过改变折折叠的条条件使蛋蛋白质恢恢复其天天然构象象的过程程，称为为复性。已已经发展展了很多多的方法法用于包包涵体的的折叠复复性，但但是这些些方法的的结果并并不可预预测，每每一种方方法都需需要对各各种实验验条件，如如变性剂剂浓度、pH、温度、蛋白质浓度、离子强度、添加剂的浓度，进行优化选择。通常包涵体在变性溶解后具有高的纯度，可以直接进行复性。但由于包涵体还含有其它的细胞成分，如膜蛋白、磷脂、核酸，可能影响蛋白质的复性（53,54），为了进

36、一步提高纯度，有些研究工作在包涵体变性后先进行蛋白的纯化，如亲和层析（47,55,57,60,63,64,65, 68）、离子交换层析（47,56）、凝胶过滤层析、反相层析（62），再进行变性蛋白质的复性，层析在变性条件下应用为这一策略提供了技术支持。为了控制折折叠、错错误折叠叠和聚集集的速率率，一种种方法是是降低变变性剂的的浓度，降降低的速速度和操操作的时时间都决决定折叠叠的效率率。另一一种方法法就是加加入添加加剂来减减少聚集集，促进进折叠，如如L-精氨氨酸，盐盐，有机机溶剂，一一些表面面活性剂剂，渗透透压调节节剂（oosmoolyttes），硫硫代甜菜菜碱类物物质（NNDSBBs），这这些

37、物质质或稳定定蛋白质质的天然然构象，或或使部分分折叠的的 HYPERLINK /industry/Special/middle/Index.shtml 中间体体不稳定定，表22 列出出了这些些化合物物和它们们可能的的作用机机制，它它们在蛋蛋白质的的折叠中中起着重重要的作作用，已已得到广广泛的应应用（113,225,332,44,744），但但对于其其中的好好些化合合物参与与折叠的的作用机机制我们们还了解解不多。表 2 增增加蛋白白质折叠叠的添加加剂添加剂可能的作用用机制甘油对蛋白质具具有优先先的水合合作用/增加黏黏度L-精氨酸酸两亲分子/渗压剂剂甘氨酰甜菜菜碱/山梨糖糖醇对蛋白质具具有优先先的

38、水合合作用阿拉伯聚糖糖增加黏度木糖醇增加黏度乙醇调节极性DMSO调节极性两性离子表表面活性性剂（ZZwittterrionnic detterggentts）保护非极性性表面Tritoon XX-1000保护非极性性表面硫代甜菜碱碱类物质质（NDDSBss）保护非极性性表面蔗糖/海藻藻糖对蛋白质具具有优先先的水合合作用/增加黏黏度N-氧化三三甲胺（TMAO）对蛋白质具具有优先先的水合合作用/渗压剂剂三氟乙醇（TFE）促进二级结结构的形形成低浓度盐酸酸胍使部分折叠叠的 HYPERLINK /industry/Special/middle/Index.shtml 中间间体不稳稳定/增加天天然构象象

39、蛋白质质的溶解解性低浓度尿素素使部分折叠叠的 HYPERLINK /industry/Special/middle/Index.shtml 中间间体不稳稳定/增加天天然构象象蛋白质质的溶解解性配体稳定天然结结构状态态聚乙二醇保护熔球体体（moolteen gglobbulee）/增加黏黏度在折叠过程程中另一一个关键键的问题题是正确确二硫键键的形成成，一旦旦形成了了错误的的二硫键键，就不不能再折折叠形成成正确的的结构，所所以在折折叠时不不仅要氧氧化促进进二硫键键的形成成，还要要加入还还原剂促促进二硫硫键改组组（diisullfidde-bbondd reeshuuffllingg），使使蛋白质质

40、最终折折叠成正正确的结结构。常常用的方方法有：1 使用用金属催催化的空空气氧化化，并添添加还原原剂促进进二硫键键改组，由由于氧在在蛋白质质溶液中中溶解性性低，这这种方法法的效率率较低，改改用搅拌拌促进氧氧的质量量传输，又又会造成成蛋白质质的聚集集；2 使用小小分子还还原型和和氧化型型的巯基基 HYPERLINK /reagent/ 试剂对，包包括还原原型和氧氧化型的的谷胱甘甘肽（GGSH/GSSSG）、半半胱氨酸酸和胱氨氨酸（ccystteinne/ccysttinee）、半半胱胺和和胱胺（cysteamine/cystamine）、二硫苏糖醇和氧化型谷胱甘肽（DTT/GSSG），二流赤藓糖醇

41、和氧化型谷胱甘肽（DTE/GSSG），这一方法是目前常用的方法，通常使用的巯基 HYPERLINK /reagent/ 试剂总浓度为5-15mM，还原剂和氧化剂的比为5:11:1（4,74）。3 在复性前将巯基保护起来，有两种方法可以选择，一是通过谷胱甘肽和蛋白的半胱氨酸残基形成二硫键来保护巯基，二是进行半胱氨酸磺酸化，从而减少复性过程中不正确的二硫键的形成，复性后再加入还原剂使形成正确二硫键。人组织纤溶酶原激活剂（t-PA）含有35个半胱氨酸残基，可形成17对二硫键，即使在天然状态下也只具有低的溶解性，进行原核表达时这两种巯基保护方法都被用于该蛋白质的折叠复性，由于在蛋白质的巯基上引入了带电

42、荷的残基，增加了变性蛋白和部分折叠 HYPERLINK /industry/Special/middle/Index.shtml 中间体的溶解性，减少了复性过程中蛋白质的聚集，可获得较高的复性效率（25,32,33）。人绒毛膜促性腺激素亚基（hCG）含有12个半胱氨酸残基，如果不进行巯基保护，在折叠复性中会形成寡聚体和大量沉淀，变性蛋白质磺酸化后再折叠复性可形成几乎100%单体蛋白，同时提高了得率和纯度（37）。此外，在前胰岛素的折叠复性中也应用了磺酸化保护（44,47,48），所以这一方法在进行复杂蛋白的变复性时可以采用。 稀释复复性和透透析复性性用折叠缓冲冲液快速速稀释溶溶解的包包涵体蛋蛋

43、白质溶溶液，达达到降低低变性剂剂浓度的的目的，使使去折叠叠的蛋白白质进行行再折叠叠，就是是稀释复复性。为为了很快快避开低低溶解性性变性剂剂区（如如图2中c区 段所示示），减减少蛋白白的聚集集，在进进行稀释释时一定定要快速速。折叠叠进行时时的蛋白白质浓度度是体外外折叠成成功的关关键，理理想的情情况是希希望折叠叠在高浓浓度的条条件下进进行，但但是在高高 浓度的的条件下下变性剂剂的稀释释常常造造成去折折叠和部部分折叠叠蛋白质质的聚集集。对于于折叠，是是一个一一级的反反应过程程，而聚聚集是一一个高级级的反应应过程，依依赖蛋白白质的浓浓度，所所以 需要小小心的选选择蛋白白质的浓浓度，一一般的蛋蛋白质的的

44、终浓度度保持在在20-50g/mmL。透析的方法法不显著著的改变变溶液的的体积，但但时间较较长，而而且易形形成蛋白白质沉淀淀，所以以透析起起始的蛋蛋白质浓浓度非常常关键，而而且仅对对一些蛋蛋白质有有效。变变性剂浓浓度的降降低也可可以分阶阶段的进进行，或或先经过过稀释，再再透析去去除剩余余的变性性剂，由由于变性性剂的浓浓度在开开始时先先降到一一定的水水平，增增加了部部分折叠叠 HYPERLINK /industry/Special/middle/Index.shtml 中间体体的溶解解性，常常常可以以提高折折叠的效效率，但但是必须须通过实实验选择择在不同同阶段使使用的变变性剂浓浓度，避避开图22

45、 所示示的c区段。除除了要考考虑降低低变性剂剂的浓度度，还要要考虑每每一阶段段的氧化化还原状状态，以以及温度度、添加加剂等因因素。在胰凝乳蛋蛋白酶原原的折叠叠复性中中，如果果盐酸胍胍稀释的的浓度低低于0.5 MM或高于于3 MM都会造造成大量量的沉淀淀，在22.5 M浓度度时有一一半的蛋蛋白质没没有正确确折叠，而而在1 M时则则完全折折叠，说说明折叠叠时的变变性剂并并不是越越低越好好，而是是存在一一个最佳佳浓度（13）。Tsumoto等通过分阶段透析进行了单链 HYPERLINK /antibody/ 抗体Fv段包涵体的折叠复性，在1M盐酸胍透析时加入氧化型谷胱甘肽和L-精氨酸可以使正确折叠蛋

46、白的得率达到95% 以上（40），进一步研究表明在1M盐酸胍条件下蛋白质所具有的结构使得自由巯基容易形成正确的二硫键，加入氧化型谷胱甘肽的作用是加速了蛋白质的正确折叠、抑制蛋白质的聚集，而L-精氨酸起的作用是稳定部分折叠的 HYPERLINK /industry/Special/middle/Index.shtml 中间体使其不发生聚集，所以同时加入氧化型谷胱甘肽和L-精氨酸可以将蛋白质的聚集降到最低的程度（41）。这个研究小组用相同的方法进行白介素-12包涵体的折叠复性，仅加入氧化型谷胱甘肽而没有还原型谷胱甘肽只有约57%的折叠效率，当两者同时加入后则可达到90%（42），这些结果表明前一种

47、蛋白比较容易形成正确的二硫键，而白介素-12折叠复性需要加入还原型的谷胱甘肽促进二硫键重组，使蛋白质最终选择天然的二硫键，并促进折叠。另一种策略略是将变变性蛋白白分成几几份按一一定的时时间间隔隔逐步加加入折叠叠缓冲液液中，可可以减少少处理的的体积、改改善折叠叠的效率率（355）。Arroraa等将这这一方法法用于人人干扰素素的复性性，当添添加0.5M的的L-精氨氨酸可以以使产率率提高十十倍，产产品的得得率和比比活比文文献报道道的都要要高（772）。在 已经发发展的复复性方法法中，稀稀释复性性仍然是是应用最最多的方方法，但但在放大大时会因因为处理理体积太太大造成成成本太太高。溶溶解复性性获得的的

48、蛋白质质，需要要通过离离心和过过滤的方方法去除除 不溶性性的物质质，再按按可溶性性蛋白质质的处理理方法进进行下游游的分离离纯化。扩扩张床吸吸附技术术可以处处理大量量的样品品，而且且分离的的效能不不受聚集集蛋白质质的影响响，Feerree等将蛋蛋白质的的稀释折折叠和扩扩张床吸吸附捕获获技术相相偶联，使使用STTREAAMLIINETTM DDEAEE阴离子子交换介介质，用用于包涵涵体蛋白白质HAAT-hh2m的分离离纯化，可可以得到到48%回收率率和944%纯度度的复性性蛋白（23）。2.1.3.22 色谱谱复性色 谱方法法不仅在在蛋白质质的纯化化中得到到广泛应应用，也也成为包包涵体蛋蛋白质复复

49、性的主主要手段段之一。色色谱复性性的方法法的优点点是可以以显著的的减少处处理的时时间，减减少变复复性过程程中分 子的聚聚集，使使复性的的同时也也达到了了纯化的的效果。第第一类型型的色谱谱复性就就是凝胶胶过滤色色谱复性性，这一一方法的的原理在在于通过过分子筛筛效应可可将蛋白白质和小小分子的的变性剂剂分 离，实实现溶液液交换和和蛋白质质的折叠叠。复性性折叠中中存在的的一个问问题就是是蛋白质质的聚集集，为了了减少导导致蛋白白质聚集集的分子子间相互互作用，可可将蛋白白质结合合在分离离介质上上，达 到溶液液中变性性剂浓度度的稀释释和蛋白白质的折折叠，这这一类型型的复性性为吸附附型色谱谱复性，包包括亲和和

50、色谱复复性，疏疏水相互互作用色色谱复性性，离子子交换色色谱复性性。对于于一些稀稀释法 难于折折叠的蛋蛋白质，这这一方法法具有更更好的效效果，如如一些膜膜蛋白（24,50,71）。在折叠中，吸附的位点会影响到折叠，所以要优化折叠的条件，才能得到好的折叠效果。另一种方法是在介质上固定化伴侣分子或折叠酶，使层析柱成为一个折叠反应器，固定化的优点是能够回收使用，不会引入新的杂蛋白。A. 凝胶胶过滤色色谱复性性凝胶过滤复复性时，变变性蛋白白质加样样于折叠叠缓冲液液平衡好好的凝胶胶过滤柱柱上，然然后用折折叠缓冲冲液进行行洗脱，凝凝胶过滤滤层析有有不同的的分子量量分级范范围，有有助于聚聚集蛋白白质和正正确折

51、叠叠蛋白质质的分离离。血小小板衍生生的生长长因子（PDGF）由两个亚基组成，Mller等用双顺反子表达载体同时表达等摩尔的A链和B链，但以包涵体的形式存在，为了得到活性的异源二聚体PDGF-AB，包涵体用盐酸胍变性后，先在变性条件下用凝胶过滤层析进行纯化，使用稀释复性，蛋白质严重聚集，即使在10g/ml蛋白质浓度条件下，也只能得到45%可溶性蛋白，而用凝胶过滤复性，同时洗脱的A亚基和B亚基可以缓慢二聚化产生异源二聚体，蛋白质以2.5mg/ml浓度上样,最终异源二聚体得率可达75%（26）。在 凝胶过过滤复性性中，发发展了一一种梯度度复性的的方法，这这一方法法的原理理基于复复性过程程中，变变性条

52、件件的快速速改变加加速了部部分折叠叠蛋白质质的聚集集，导致致沉淀形形成和非非特异性性的吸 附，通通过梯度度洗脱逐逐步降低低变性剂剂的浓度度，使蛋蛋白质处处于一个个梯度改改变的变变性剂条条件下，控控制蛋白白质的折折叠和聚聚集速度度，使蛋蛋白质在在离开层层析柱时时，处于于折叠缓缓冲液 中，从从而改善善活性蛋蛋白的回回收率。通通常选择择线性的的梯度用用于折叠叠复性，对对于不同同的蛋白白质还有有其它的的模式，如如一些蛋蛋白在特特定的变变性剂浓浓度范围围里不稳稳定，在在此变性性 剂浓度度范围里里就需要要快速降降低变性性剂浓度度。这一一复性过过程中，梯梯度在上上样前就就在层析析柱中已已经形成成，上样样后使

53、用用变性缓缓冲液进进行洗脱脱，由于于蛋白质质受到的的分子排排阻比 变性剂剂大，蛋蛋白质移移动的速速度比变变性剂梯梯度移动动的速度度快，最最终蛋白白质通过过整个变变性剂区区，离开开层析柱柱时处于于折叠缓缓冲液中中。通过过尿素线线性梯度度复性，变变性溶菌菌酶以 高蛋白白浓度上上样（117mgg/mll）可以以获得990%的的活性回回收率，与与稀释复复性和非非梯度凝凝胶过滤滤复性相相比较，显显著的改改善了活活性回收收率（227）。对对单链FFv片段段包涵体体蛋白，使使用梯度度同时改改变变性性剂浓度度和pHH，比单单改变变变性剂浓浓度的梯梯度复性性或不使使用梯度度的凝胶胶过滤复复性具有有更高的的活性得

54、得率（228）。另另外应用用连续环环形色谱谱，蛋白白样品连连续上样样于旋转转的色谱谱柱上，在在提高折折叠效率率的同时时，也提提高了色色谱复性性处理的的能力（29,30）。B. 吸附附型色谱谱复性吸 附型色色谱复性性是在变变性条件件下，利利用变性性蛋白质质可瞬间间结合在在特定层层析介质质上的特特性，进进行缓冲冲液的交交换，降降低变性性剂的浓浓度，可可先改变变变性剂剂浓度使使吸附的的蛋白质质 逐渐的的折叠复复性，在在柱中的的变性剂剂溶液完完全被置置换成折折叠缓冲冲液后，再再通过在在折叠缓缓冲液中中加入盐盐或其它它添加剂剂进行原原位纯化化洗脱，为为了获得得好的折折叠效率率和纯化化效 率，常常采用梯梯

55、度洗脱脱或阶段段洗脱的的方法。由由于蛋白白质结合合在固相相介质上上，减少少了折叠叠过程中中由于分分子间相相互作用用所造成成的聚集集，所以以这一方方法可提提高折叠叠的效率率。在 变性条条件下，蛋蛋白质能能否进行行离子交交换色谱谱复性和和疏水色色谱复性性，与蛋蛋白质的的理化性性质密切切相关，仅仅有有限限的报道道（366），而而给蛋白白质加上上一个亲亲和标签签，表达达得到的的包涵体体再用亲亲和色谱谱复性对对不同的的蛋白质质有一定定的通用用性，应应用也更更为广泛泛，尤其其是金属属螯合亲亲和色谱谱复性。多肽通过在在N端或C端加上上一个亲亲和标签签，在包包涵体的的纯化上上有两个个方面的的用途，其其一是包包

56、涵体变变性溶解解后，利利用亲和和色谱直直接进行行包涵体体溶液的的纯化，再再用稀释释或透析析的方法法进行复复性(555,557,660,664,665,668)，其其二就是是用于亲亲和色谱谱复性(61,66,67,69,70)。由于于蛋白质质或肽类类标签在在变性条条件大多多失去了了与亲和和介质结结合的特特性，目目前这一一技术用用的最多多的是组组氨酸标标签。ZZahnn等在镍镍亲和层层析柱（Ni-NTA argrose）上通过盐酸胍/谷胱甘肽梯度进行带有组氨酸标签的人朊病毒蛋白多肽片段的氧化再折叠，抑制了蛋白质聚集和分子间二硫键的形成，再用咪唑缓冲液对目标蛋白进行洗脱，纯化的流程图如图4所示(20

57、)。Stempfer等在-葡萄糖苷酶的N端或C端加上多聚精氨酸标签，研究了变性蛋白在肝素亲和介质上的折叠复性，通过优化实验条件，蛋白质可以在5mg/ml浓度条件下高效复性(59)。图4：利用用金属螯螯合色谱谱复性纯纯化人朊朊病毒蛋蛋白多肽肽片段的的流程图图除了以上的的应用，更更令人鼓鼓舞的是是这一技技术已成成功用于于膜蛋白白的复性性（244,500,711）。酮酮戊二酸酸载体蛋蛋白是线线粒体内内膜上的的一种转转运蛋白白，Smmithh先采用用E.ccolii C441（DE33）作为为宿主菌菌使C端带有有组氨酸酸标签的的目标蛋蛋白形成成包涵体体获得大大量表达达，再用用镍柱亲亲和色谱谱进行复复性

58、和纯纯化，获获得的融融合蛋白白具有和和天然蛋蛋白一样样的转运运活性，每每升的细细菌培养养液可获获得155mg的的活性蛋蛋白（550）。C. 由固固定化伴伴侣分子子和/或折叠叠酶介导导的色谱谱复性分子伴侣和和折叠酶酶在蛋白白质的正正确折叠叠中起着着重要的的作用，是是近年来来的一个个研究热热点，它它们和蛋蛋白质在在体内共共表达已已经成为为促进蛋蛋白质可可溶性表表达的重重要方法法。分子子伴侣和和折叠酶酶在体外外有两个个方面的的应用，其其一是在在溶液中中加入伴伴侣分子子和/或折叠叠酶促进进包涵体体蛋白质质的折叠叠和装配配（399），另另一方面面就是通通过固定定化的伴伴侣分子子和/或折叠叠酶来介介导蛋白

59、白质的折折叠复性性。Alltammiraano等等通过固固定化伴伴侣分子子GrooEL的的活性小小片段、脯脯胺酰异异构酶和和大肠杆杆菌氧化化还原酶酶DsbbA将蝎蝎子毒素素蛋白CCn5的的折叠得得率从55%提高高到877%（18）。在在单链 HYPERLINK /antibody/ 抗抗体Fvv段的透透析复性性中，加加入固定定化的氧氧化还原原酶DsbAA和DsbbC可以以显著提提高折叠叠的效率率，得到到的单链链 HYPERLINK /antibody/ 抗体Fvv段和天天然 HYPERLINK /antibody/ 抗体体Fv段具具有相同同的功能能（466）。 其它的的复性方方法近年，还有有一

60、些其其它的方方法用于于蛋白质质的折叠叠复性，如如双水相相萃取复复性（776,777,778,779），反反向胶束束复性（33,75,80），高静力压复性（31,81,82,83），这些方法对特定的蛋白质可获得高的复性效率，大多还停留在研究阶段，相信随着方法的成熟和普及，将会为包涵体蛋白质的折叠复性提供更多的选择手段。2.2可溶溶重组分分子的分分离纯化化重 组蛋白白在大肠肠杆菌中中得到表表达以后后，首先先必须从从细菌释释放才能能进行下下游的分分离纯化化过程。蛋蛋白质释释放的方方法依赖赖于蛋白白质最终终在细胞胞中的定定位。大大部分的的可溶性性重组 蛋白在在细胞质质中表达达，而一一些膜蛋蛋白常常常表