全长cDNA文库的构建-SMART技术

1、【共享】全长cDNA文库的构建一 SMART技术全长cDNA文库的构建一SMART技术 真核细胞的mRNA在加工过程中有一个比喻为穿鞋戴帽的过程，因此mRNA 的末端都带有一段Poly A,这是利用逆转录酶制备cDNA文库的基础。但是由 于cDNA的5端的序列各不相同，如何获得全长的cDNA，如何扩增由 微量的 mRNA 逆转录得到的 cDNA 文库、如何利用已知片断序列得到全长的 cDNA （即RACE），曾经是一个令人困扰的问题。常见的做法是在合成 cDNA 的双链后在两端连上接头，利用已知的接头序列再 进行扩增，或者是利用末端转移酶在双链 cDNA 的 3末端加上一连串的 G或者C （或

2、者A/T），再通过补齐粘末端，利用已知的两头序列进行扩增。但 是这些方法不同程度的存在一些问题，比如接头的连接效率非常有限，会导致部 分信息的丢失，再加上这些方法需要多次用不同的酶处理有限的样品，需要经过 反复的纯化，会损失很多有用的信息，特别是少量样品中的低丰度信息，很大程 度上会影响结果的准确性。另外由于 mRNA 容易部分降解，很难确定得到的 cDNA是否就是全长的cDNA，还是cDNA的片断。SMART技术的出现是一个新的里程碑。这个称作Switching Mechanism At 5 end of the RNA Transcript（SMART）,原理实际上非常简单：在合 成cDN

3、A的反应中事先加入的3末端带Oligo （dG）的SMART引物， 由于逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA，在到达mRNA的5末端时 碰到真核mRNA特有的帽子结构，即甲基化的G时会连续在合成的cDNA末 端加上几个（dC）, SMART引物的Oligo（dG）与合成cDNA末端突出的几 个C配对后形成cDNA的延伸模板，逆转录酶会自动转换模板，以SMART引 物作为延伸模板继续延伸 cDNA 单链直到引物的末端，这样得到的所有 cDNA 单链的一端有含Oligo（dT）的起始引物序列，另一端有已知的SMART引物序 列，合成第二链后可以利用通用引物进行扩增。由于有 5帽子结构的 mRNA才

4、能利用这个反应得到能扩增的cDNA，因此扩增得到的cDNA就是全 长 cDNA。这个专利的方法是利用逆转录酶内源的末端转移酶活性，只要单管，一步即可完 成，不需要额外的 cDNA 抽提纯化或者沉淀，或者额外的酶反应，只需要少至 25ng的mRNA或者50ng的Total RNA就可以得到高质量、高产量的cDNA 库，更重要的是得到的cDNA能够代表原有样品中的mRNA的丰度，可以应用 于直接扩增基因、构建cDNA文库、已知序列钓全长cDNA（RACE），和用于 芯片检测的cDNA探针的扩增等。我们在这里分别介绍几个采用SMART技术的产品：、 SMART PCR cDNA Synthesis

5、Kit这个试剂盒是采用 SMART 技术将少至 25ng 的 mRNA 或者 50ng 的 Total RNA制备成可大量扩增的cDNA,提供包括SMART引物、CDS引物、PCR引 物、合成第一链 Buffer、dNTP、DTT、Advantage PCR Kit(15rxns)和纯化 cDNA用的纯化柱和对照RNA在内的试剂。其中CDS引物是含有经过修饰的 Oligo(dT)的起始引物，能特异结合在mRNA加Poly A的位置，避免结果有 过长的Poly A影响后继的测序或者PCR反应，同时也可以作为PCR的3 引物。合成的cDNA可以直接进行对数扩增或者线性扩增，可以作为定量PCR 的模

6、板，也可以直接用于Clontech的抑制性消减杂交，构建cDNA文库或者做 反向Northern杂交(Virtual Northern Blot)，还有用于芯片检测的cDNA 探针制备。二、SMART cDNA Library Construction Kit常规的建库需要在合成的 cDNA 双链两端通过连接加上相同或者不同的 adaptor，用相应的酶切后可以插入载体中。由于连接效率低往往导致低丰度或 者是较长的 cDNA 信息的丢失，使文库偏重高丰度和较短的基因，失去应有的 代表性。在做表达文库时，如果 cDNA 的两端是同一个酶切位点，由于 cDNA 可能按两个不同的方向接入载体，反向接

7、入载体的那些 cDNA 不能正确表达， 因而有50%的可能丢失。然而用两个不同的Adaptor又会涉及双酶切以及双酶 切是否完全的问题，影响产率。另外由于表达时 3 个碱基代表一个氨基酸，不 同的表达框架会得到不同的产物，因此正向插入一个表达载体的cDNA只有1/3 的可能得到正确的产物。虽然一度有ABC表达载体的解决方法，但是一段DNA 同时插入3个载体的机会是有限的。利用SMART技术建库，可以得到全长的cDNA文库，也不需要Adaptor的连 接。这个试剂盒的SMART引物和CDS引物与前面的试剂盒略有不同，分别带 有一个不完全相同的 SfiI 酶切位点。 SfiI 是一个在真核生物基因

8、组中极为稀少 的酶，出现的频率要远远小于Notl、EcoRI等识别6个碱基位点的酶。SfiI识 别序列为GGCCNNNN人NGGCC，中间的5个碱基为任意序列。因而两个引物 分别带有一个不完全相同的 SfiI 位点就是说两个位点的中间 5 个碱基不同。这 样经过SMART技术合成两端分别带有SMART引物和CDS引物的cDNA经过 扩增后用SfiI单酶切，得到的是两端的粘端不同的cDNA，这样就可以定向插 入特定的载体中，不会浪费 50%的信息。这个试剂盒提供的载体也很有特色：lambdaTriplex2载体有特别设计，可以用 3个不同的表达框架分别同时表达一段插入的DNA。这样就保证插入的片

9、断的 正确的表达产物能被筛选出来而不会漏掉。三、SMART RACE cDNA Amplification Kit对于DD-PCR或者SSH、RNA指纹、EST芯片等方法得到DNA片断，要钓 全长cDNA，或者用同源序列钓其他物种中的同源基因，3端的扩增一般 都不成问题，难就难在 5端的片断扩增。利用 SMART 技术将 SMART 引物自动加入cDNA的5端，不但能避免加接头或者加一串碱基的麻烦， 而且能得到全长的cDNA 5端。只要少至25个碱基的已知序列即可钓出全长的 cDNA。四、Altas SMART Probe Amplification Kit由于DNA芯片上的点多，每个点的样品量很有限，要足够的灵敏度需要有足够 多的探针。当制备探针的样品来源有限时，这个试剂盒就是解决办法之一：利用 SMART技术可以将少至1000个细胞来源的RNA制备得到足够的cDNA探针。 得到的探针能代表mRNA原有的丰度，而且操作简单。五、即将推出的Super SMART PC