消毒剂与抗抑菌剂中抗真菌药物的检测方法和评价要求

1、 消毒剂与抗抑菌剂中抗真菌药物的检测方法和评价要求范围本标准规定了消毒剂与抗抑菌剂中抗真菌药物的检测方法和评价要求。本标准适用于消毒剂与抗抑菌剂中灰黄霉素、硝酸益康唑、氟康唑、酮康唑、克霉唑、联苯苄唑、硝酸咪康唑、氟胞嘧啶、盐酸萘替芬及其它抗真菌药物的测定和评价。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法中华人民共和国药典（二部）（2015版）国家药典委员会 术语和定义下列术语和定义适用于本文件抗真菌药物 a

2、ntifungal agents具有抑菌和（或）杀菌特性、用于预防和治疗真菌性感染的药物，包括抗生素和按处方药物管理的化学合成药物。检测方法原理样品经1%甲酸乙腈超声提取后，膏霜剂型经N-丙基乙二胺净化，其他剂型不需净化，液相色谱-串联质谱法测定，外标法定量。试剂和材料本方法所用试剂均为色谱纯，实验用水为GB/T6682规定的一级水。试剂乙腈（CH3CN）。甲酸（HCOOH）。N-丙基乙二胺（C5H14N2，PSA）。试剂配制0.1%甲酸水溶液：取甲酸1.0mL，用水定容至1000mL。1%甲酸水溶液：取甲酸10.0mL，用水定容至1000mL。0.1%甲酸乙腈溶液：取甲酸1.0mL，用乙腈定

3、容至1000mL。1%甲酸乙腈溶液：取甲酸10.0mL，用乙腈定容至1000mL。0.1%甲酸乙腈水溶液：取乙腈300mL，加入甲酸1.0mL，用水定容至1000mL。标准品灰黄霉素、酮康唑、克霉唑、硝酸益康唑、硝酸咪康唑、氟康唑、联苯苄唑、氟胞嘧啶、盐酸萘替芬标准物质：纯度均98.5%或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质，其他相关信息见附录A。标准溶液配制标准储备液：准确称取标准品50mg（精确至0.1mg），用少量乙腈溶解后，转移至置50mL容量瓶中，加乙腈使溶解并定容至刻度，摇匀，即得质量浓度为1000ug/mL的标准储备溶液，-18-22冷冻保存，有效期3个月。混合标准中间液的配制

4、：取上述标准储备液适量，用乙腈配置成酮康唑浓度为10g/mL、氟胞嘧啶浓度为5g/mL、氟康唑、灰黄霉素、联苯苄唑浓度为1mg/L、硝酸益康唑、硝酸咪康唑、盐酸萘替芬和克霉唑浓度为0.5g/mL的混合标准中间，冷藏避光保存，有效期1个月。混合标准溶液：吸取不同体积的混合标准中间液，用空白样品提取液配制成适当浓度的标准工作溶液，如酮康唑的浓度为10g/L、25g/L、50g/L、100g/L、150g/L、200g/L，氟胞嘧啶的浓度为5g/L、12.5g/L、25g/L、50g/L、75g/L、100g/L，氟康唑、灰黄霉素、联苯苄唑的浓度为1g/L、2.5g/L、5g/L、10g/L、15g

5、/L、20g/L，硝酸益康唑、硝酸咪康唑、盐酸萘替芬和克霉唑的浓度为0.5g/L、1.25g/L、2.5g/L、5g/L、7.5g/L、10g/L，临用现配。材料有机系滤膜：孔径为0.22m。仪器和设备超高效液相色谱-串联质谱仪：带电喷雾离子源。分析天平：最小分度值0.1mg。离心机：转速9000r/min。涡旋混合器。超声波清洗器。分析步骤样品前处理膏霜剂型称取0.5g（精确至1mg）试样置于15mL离心管中，加入8.0mL1%甲酸乙腈，涡旋1min，加入50mg N-丙基乙二胺，超声提取30min，离心（9000r/min）5min，将上清液转移至10mL容量瓶，1%甲酸乙腈定容至刻度。混

6、匀后取1.0mL置于10mL容量瓶，用0.1%甲酸乙腈水溶液定容至刻度，混匀后转移至离心管，离心（9000r/min）5min，取上清液经滤膜过滤后备用。其他剂型称取0.5g（精确至1 mg）试样置于15mL离心管中，加入8.0mL1%甲酸乙腈，涡旋1min，超声提取30min，离心（9000r/min）5min，将上清液转移至10mL容量瓶，1%甲酸乙腈定容至刻度。混匀后取1.0mL置于10mL容量瓶，用初始流动相定容至刻度，混匀后转移至离心管，离心（9000r/min）5min，取上清液经滤膜过滤后备用。样品测定液相色谱参考条件色谱柱：C18柱（柱长100mm，内径为2.1mm，粒径为1.

7、7m）或相当者；流动相：A相为0.1%甲酸水溶液，B相为1%甲酸乙腈溶液；流速：0.3mL/min；柱温：30；进样体积：2L；梯度洗脱程序：见附录B。质谱参考条件电离方式：ESI+；离子源温度：150；毛细管电压：3.0Kv；脱溶剂气温度：400；脱溶剂气（N2）流量：800L/h；锥孔气（N2）流量：150L/h；碰撞气及碰撞室压力：7.010-3mPa；监测方式：多反应监测（MRM）模式；其他质谱参数：见附录C。标准曲线的制作将混合标准系列溶液，按浓度由低到高依次注入液相色谱串联质谱仪中，测得相应的峰面积。以各抗真菌药物标准工作溶液的浓度为横坐标，以各抗真菌药物的峰面积为纵坐标，绘制标准

8、曲线，以离子对定性，采用外标法进行定量分析，标准图谱见附录D。定性测定在相同测试条件下，试样中目标化合物色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰的保留时间相比较，变化范围在2.5%以内，且检测到的相对离子丰度，应与浓度相当的标准溶液中相对离子丰度一致，其相对丰度比偏差应符合表1要求。相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度（%）5020至5010至2010允许的最大偏差（%）20253050定量测定按照外标法进行定量计算，标准溶液和试样溶液中抗真菌药物的响应值均应在仪器线性响应范围内。如果含量超过标准曲线范围，应稀释到合适浓度后分析。测定将试样溶液注入液相色谱串联质谱仪中，以保留时间和两对离子（特征离子

9、对/定量离子对）所对应的色谱峰面积相对丰度进行定性，根据标准曲线计算试样溶液中目标化合物的质量浓度。空白试验除不加试样外，均按上述步骤进行。结果计算和表述试样中目标化合物的含量按式（1）计算： （ SEQ 标准自动公式 * ARABIC 1）式中：X试样中目标化合物的含量，单位为微克每千克（g/kg）；C由标准曲线计算出的试样溶液中目标化合物的浓度，单位为微克每升（g/L）；V定容体积，单位为毫升（mL）；K稀释倍数；m样品称样量，单位为克（g）。计算结果保留三位有效数字。精密度在重复性条件下获得的两次独立测XX果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。检出限和定量限当取样量为0.5g，定量体积

10、为10mL时，本方法的检出限和定量限见附件E。其他抗真菌药物的检测方法可参照中华人民共和国药典方法并进行方法验证后执行。若中华人民共和国药典未涵盖的抗真菌药物的检测方法。可参考文献报道的方法，并通过认证后方可使用。评价要求消毒剂与抗抑菌剂中不得添加任何抗真菌药物。抗真菌药物在消毒剂与抗抑菌剂中含量或总量均不得超过100mg/kg。其他抗真菌药物在消毒剂与抗抑菌剂中的含量或总量不得超过外用药物最小规格的1%。（规范性附录）标准品相关信息标准品相关信息抗真菌药英文名称分子式CAS序号化学结构式灰黄霉素GriseofulvinC17H17ClO6126-07-8酮康唑KetoconazoleC26H

11、28Cl2N4O465277-42-1克霉唑ClotrimazoleC22H17ClN223593-75-1硝酸益康唑Econazole NitrateC18H16Cl3N3O468797-31-9硝酸咪康唑Miconazole NitrateC18H15Cl4N3O422832-87-7氟康唑FluconazoleC13H12F2N6O86386-73-4联苯苄唑BifonazoleC22H18N260628-96-8氟胞嘧啶FlucytosineC4H4FN3O2022-85-7盐酸萘替芬Naftifine hydrochlorideC21H22ClN65473-14-5（资料性附录）液相

12、色谱梯度洗脱程序液相色谱梯度洗脱程序时间（min）A（%）B（%）095519553554544060910909.501001095513955（资料性附录）质谱参考条件质谱参考条件编号物质名称母离子（m/z）锥孔电压（V）子离子（m/z）碰撞能量（eV）1灰黄霉素353.035165.0*2535215.0202酮康唑531.059489.0*2959255.0363克霉唑277.045165.0*2545241.0254硝酸益康唑381.031125.0*3131193.0185硝酸咪康唑417.048159.0*3548161.0326氟康唑307.042238.0*1542220.0

13、167联苯苄唑311.023243.0*1423165.0188氟胞嘧啶130.021113.0*172185.0209盐酸萘替芬288.026117.0*1526141.020带*的离子为定量离子。（资料性附录）标准图谱标准图谱1:灰黄霉素（3.89min）；2:酮康唑（3.83min）；3:硝酸咪康唑（5.69min）；4:硝酸益康唑（5.22min）；5:联苯苄唑（4.41min）；6:氟康唑（2.96min）；7:盐酸萘替芬（4.13min）；8:克霉唑（4.32min）；9:氟胞嘧啶（0.80min） （资料性附录）方法检出限和定量限方法检出限和定量限抗真菌药检出限（mg/kg）定量

14、限（mg/kg）灰黄霉素0.060.2酮康唑0.62.0克霉唑0.030.1硝酸益康唑0.030.1硝酸咪康唑0.030.1氟康唑0.060.2联苯苄唑0.060.2氟胞嘧啶0.31.0盐酸萘替芬0.030.1（资料性附录）方法回收率膏霜剂型的各添加浓度的回收率与精密度膏霜剂型中抗真菌药物的的回收率抗真菌药添加浓度（mg/kg）回收率范围（%）精密度（n=8，%）灰黄霉素487.5103.03.08188.0104.35.340.580.0100.63.80酮康唑4076.087.13.251074.4102.44.38588.499.25.45克霉唑284.096.03.760.583.09

15、9.04.120.2585.0105.05.33硝酸益康唑288.098.03.660.592.095.44.320.2580.0104.03.22硝酸咪康唑292.0105.03.530.592.0104.04.550.2580.096.05.26氟康唑478.695.04.40178.098.25.550.580.0102.36.15联苯苄唑489.599.14.66185.0103.53.220.586.5101.93.16氟胞嘧啶2084.3103.22.52589.598.83.052.584.8106.44.15盐酸萘替芬282.097.03.400.584.0102.05.050.2580.095.05.85其他剂型的各添加浓度的回收率与精密度其他剂型中抗真菌药物的回收率抗真菌药添加浓度（mg/kg）回收率范围（%）精密度（n=8，%）灰黄霉素482.594.54.24178.094.03.040.580.0104.04.77酮康唑4073.590.33.991081.590.44.75584.295.65.05克霉唑288.0100.03.730.572.088.04.030.2580.096.05.55硝酸益康唑290.097.03.580.590.098.55.220.2